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發(fā)布時(shí)間：2021/6/17 9:25:55 閱讀次數(shù)：1241
轉(zhuǎn)染（Transfection）是指將DNA或者RNA導(dǎo)入真核細(xì)胞中的過程。轉(zhuǎn)染的目的是產(chǎn)生重組蛋白，或特異性增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染有哪些類型和方法呢？
1）根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細(xì)胞的時(shí)間長(zhǎng)短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。
| 瞬轉(zhuǎn) | 穩(wěn)轉(zhuǎn) |
| 導(dǎo)入的DNA沒有整合到基因組中，而是保留在細(xì)胞核上 | 導(dǎo)入的DNA整合到基因組中 |
| 導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)不傳遞到子代； 遺傳改變只是暫時(shí)的 | 導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)能夠代代相傳；遺傳改變是永久的 |
| 不需要選擇性篩選 | 需要選擇性篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 |
| DNA載體和RNA都可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 只有DNA載體可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；RNA本身不能穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞中 |
| 導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)的高拷貝數(shù)導(dǎo)致高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。 | 單拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的穩(wěn)定整合的DNA導(dǎo)致較低水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。 |
| 通常在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)內(nèi)收獲細(xì)胞。 | 需要2-3周的時(shí)間篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。 |
| 通常不適合使用具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體的研究。 | 適用于使用帶有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體的研究。 |
2）根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)，生物，物理方法。
| 轉(zhuǎn)染類型 | 轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 應(yīng)用 | 特點(diǎn) |
| 化學(xué)轉(zhuǎn)染法 | 磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)轉(zhuǎn)， 瞬轉(zhuǎn) | 不適用于原代細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用 |
| 陽離子 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)轉(zhuǎn)， 瞬轉(zhuǎn) | 適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 | |
| DEAE-右旋糖苷法 | 帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬轉(zhuǎn) | 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)，但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清 | |
| 生物轉(zhuǎn)入法 | 病毒介導(dǎo)法 | 通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 | 穩(wěn)轉(zhuǎn) | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒 | 特定宿主 | 但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素 | ||
| 腺病毒 | 通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 | |
| 物理轉(zhuǎn)染法 | Biolistic顆粒傳遞法 | 將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放表達(dá) | 瞬轉(zhuǎn) | 可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞 |
| 電穿孔法 | 高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn) | 適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大 | |
| 顯微注射法 | 用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 | 穩(wěn)轉(zhuǎn)，瞬轉(zhuǎn) | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞 |
二、 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
1、材料
293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)
2、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD
3、實(shí)驗(yàn)步驟
細(xì)胞傳代
(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。
(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。
(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。
(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。
(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。
(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。
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