操作規(guī)程

        一、復(fù)蘇                                                                                                                                              

       1、事先用Matrix進(jìn)行培養(yǎng)皿/板的包被處理。平時(shí)Matrix保存在-20℃，使用之前放在4℃冰箱或冰上進(jìn)行解凍。待Matrix解凍后，按1：100的比例迅速用PBS液體稀釋。按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量加入，加入后迅速搖動皿/板，使加入的Matrix完全覆蓋整個皿底。放到37℃培養(yǎng)箱中4小時(shí)，使用前去掉包被液（如果暫時(shí)不使用，用封口膜密封，在4℃冰箱能保存一周）。
       2、復(fù)蘇前準(zhǔn)備iCell解凍完全培養(yǎng)基（iCell解凍液基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及iCell解凍液添加劑）。加入適量的解凍液（6孔板每孔加2ml，150px皿加3ml，250px皿加9ml），另加入10ug/ml的Y27632因子，放入37℃培養(yǎng)箱中。
       3、復(fù)蘇一支細(xì)胞用5ml的上述混合培養(yǎng)基，復(fù)蘇之前要在37℃水浴鍋里充分預(yù)熱。從液氮罐里取出凍存管后，迅速轉(zhuǎn)移到生物安全柜中（如果液氮罐的位置距離安全柜遠(yuǎn)，要用裝有液氮的容器把凍存管轉(zhuǎn)移到安全柜），并用加熱好的完全培養(yǎng)基進(jìn)行解凍（用移液槍不停的往凍存管中打入—抽出培養(yǎng)基，交換溶解開的細(xì)胞，直至完全溶解）。
       4、200Xg離心5分鐘，去掉上清液，加入1ml的iCell完全解凍培養(yǎng)基（含10ug/ml的Y27632因子），用手指彈碎管內(nèi)沉淀。按接種到每孔板/皿1ml的量，補(bǔ)充iCell完全解凍培養(yǎng)基到離心管中，輕輕吹吸三四次后加入培養(yǎng)皿/板中。水平十字振動使細(xì)胞均勻分布，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
       5、24小時(shí)后換成iCell完全培養(yǎng)基（iCell基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及iCell基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加劑）。以后每隔22—24小時(shí)換液。細(xì)胞長滿80-90%需要傳代或凍存。

       二、傳代/凍存
       1、傳代前要進(jìn)行培養(yǎng)皿/板的包被處理，做法與復(fù)蘇時(shí)相同。培養(yǎng)基為iCell完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入10ul/ml的Y27632因子。
       2、傳代/凍存前，準(zhǔn)備37℃預(yù)熱好的無鈣鎂離子PBS溶液及傳代工作液（0.5mM EDTA+0.025%胰酶）。
       3、吸走iCell完全培養(yǎng)基，并加入37℃預(yù)熱好的PBS溶液清洗二次。
       4、加入適量（按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量）的37℃預(yù)熱好的傳代工作液。
       5、37℃放置4-5分鐘（前一分鐘過后拿出來，用手指輕彈幾下板/皿的底部），顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)間隙但尚未相互分離，肉眼觀察到細(xì)胞集落變得不透明且發(fā)白，表明細(xì)胞消化時(shí)間理想。
       6、迅速吸去傳代液，加入適量的iCell完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器扇形吹打皿/板底部（吹打不用超過10次），使附著的細(xì)胞集落脫落。（如果消化時(shí)間不當(dāng)，致使細(xì)胞完全從皿/板底剝離的情況，不用吸出傳代液，加入同等量的iCell完全培養(yǎng)基終止消化）。
        7、移入離心管，離心后重懸。傳代比例為1：8—1：12；凍存按6孔板每孔凍1支，150px皿凍2-4支，250px皿凍6-12支。每支加入0.8ml的90%iCell完全培養(yǎng)基與10%的DMSO。
        8、復(fù)蘇時(shí)按凍存前的1：4—1：6的比例進(jìn)行。
 
 
        注意事項(xiàng)：
        1、每次換液時(shí)要觀察細(xì)胞生長狀況以及細(xì)胞形態(tài)的變化并對細(xì)胞進(jìn)行拍照，但是在培養(yǎng)箱外操作的時(shí)間不要過長，避免因溫度對細(xì)胞生長狀態(tài)造成不利影響。
        2、更換培養(yǎng)基之前，要對新的培養(yǎng)基進(jìn)行37℃預(yù)熱。為了避免反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的培養(yǎng)基中各種成分的影響，只對本次要更換的量進(jìn)行預(yù)熱處理。
       3、用移液器吹打細(xì)胞，因?yàn)橐埔汗艿亩瞬枯^為圓滑，對細(xì)胞傷害的程度小于用1ml的槍。

       4、細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)要及時(shí)傳代，否則會造成細(xì)胞形態(tài)的變化。但是，如果細(xì)胞在鋪板時(shí)混合不均勻，而形成部分集落過大的情況，即使沒有達(dá)到80-90%也要進(jìn)行傳代。

iCell-CRO實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)介紹：

    一站式細(xì)胞解決方案

    針對基礎(chǔ)及臨床研發(fā)中的原代細(xì)胞和iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，由于原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)難度大，iPS細(xì)胞制作和分化的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，除長期進(jìn)行原代和iPS培養(yǎng)工作的實(shí)驗(yàn)室，想要獲得足夠量的狀態(tài)好的細(xì)胞比較困難。

   依靠多年在細(xì)胞培養(yǎng)方面的積累，為客戶提供完整的細(xì)胞CRO解決方案。根據(jù)客戶需求，直接在細(xì)胞水平進(jìn)行藥物或者試劑的刺激，觀察細(xì)胞狀態(tài)的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化，也可以先制作動物模型，對動物進(jìn)行處理后，分離特定的原代細(xì)胞進(jìn)行需要的檢測。

    同時(shí)，我們可以依照客戶提供的具體實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行操作，也可以根據(jù)客戶要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并根據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)的規(guī)模和難度提供詳細(xì)的報(bào)價(jià)和實(shí)驗(yàn)周期規(guī)劃。

服務(wù)項(xiàng)目：

服務(wù)流程：

    1.聯(lián)系我們，溝通客戶實(shí)驗(yàn)計(jì)劃及目標(biāo)，評估實(shí)驗(yàn)的的可行性。

    2.依照客戶要求，設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)；或客戶已有實(shí)驗(yàn)方案發(fā)送給我們，我們研究方案的可操作性。

    3.確定最終的實(shí)驗(yàn)方案，報(bào)價(jià)和周期。

    4.簽訂服務(wù)合同，支付預(yù)付款。

    5.開始實(shí)驗(yàn)服務(wù)，并定期向客戶反饋和交流。

    6.實(shí)驗(yàn)完成，提供完整實(shí)驗(yàn)說明和部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    7.支付尾款，向客戶提供完整的全部實(shí)驗(yàn)報(bào)告和原始數(shù)據(jù)。

    8.項(xiàng)目完成。