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發(fā)布時(shí)間:2021/6/17 9:31:05 閱讀次數(shù):535
法。目前,常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法主要分為三類途徑:物理介導(dǎo)(電穿孔法,基因槍法、顯微注射法)、化學(xué)介導(dǎo)(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物介導(dǎo)法)、生物介導(dǎo)(病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染)。
理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)室常用的轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,陽離子聚合物轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)染,不同的轉(zhuǎn)染方法各有利弊,針對細(xì)胞的習(xí)性和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目蛇x擇相對合適的轉(zhuǎn)染方法。
一般來說,原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染難度是比較大的,雖然眾所周知,原代細(xì)胞研究具有非常重要的生物學(xué)意義,但是轉(zhuǎn)染效率低下一直是制約其發(fā)展的主要因素。
本文我們主要介紹一種常用的適用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法:脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。
---陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。
常用的脂質(zhì)體主要有兩種,Lipofectin和Lipofectamine。前者是一種陽離子脂質(zhì)試劑,可與靶DNA的磷酸骨架結(jié)合形成復(fù)合物,該復(fù)合物能輕易通過細(xì)胞膜從而完成轉(zhuǎn)染過程。Lipofectin可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和寡核苷酸至各種動物細(xì)胞,并可將DNA導(dǎo)入植物原生質(zhì)體。Lipofectamine是一種多陽離子轉(zhuǎn)染試劑,其頭部具獨(dú)特的精胺基團(tuán),該基團(tuán)的強(qiáng)負(fù)電子性使Lipofectamine具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染能力。
實(shí)驗(yàn)步驟
(一)貼壁細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)染
1. 在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種2ml(完全培養(yǎng)基)約1.3×105細(xì)胞。
2. 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至50-80%豐度。
3. 在兩個(gè)1.5ml離心管中準(zhǔn)備如下溶液:
溶液A:溶1-2 μg DNA于100μl無血清培養(yǎng)基中
溶液B:溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL:LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl無血清培養(yǎng)基中
4. 將上述A、B兩液混合,室溫下放置15-45分鐘。此時(shí)可將細(xì)胞用2ml無血清培養(yǎng)基漂洗1-2遍。
5. 混合的A、B兩液中加入0.8ml無血清培養(yǎng)基,混勻,平鋪在漂洗過的細(xì)胞上。如果細(xì)胞對無血清耐受能力差,這一步可加入血清。但是在轉(zhuǎn)染過程中不要加入抗生素(antibiotic)。
6.37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2-24小時(shí)。
7. 加入lml培養(yǎng)基(含兩倍于正常濃度的血清)。若血清已加入,這一步可加入lml正常的完全培養(yǎng)基。
8. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時(shí)換入新鮮的完全培養(yǎng)基。
9.根據(jù)細(xì)胞類型及啟動子的活性,在24-72小時(shí)可對基因的表達(dá)活性進(jìn)行分析。
10. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時(shí),可將細(xì)胞按1:10傳入選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。
(二)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
1. 用無血清、無抗生素(antibiotic)的培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞1-2遍。
2.在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種0.8ml(無血清培養(yǎng)基)約2-3×106細(xì)胞。
3. 在兩個(gè)1.5ml離心管中準(zhǔn)備如下溶液:
溶液A:溶1-2μgDNA于100μl無血清培養(yǎng)基中
溶液B:溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL:LIPOFECTAMINETM Reagent)無血清培養(yǎng)基中
4.將上述A、B兩液混合,室溫下放置15-45分鐘。
5.將混合液加入細(xì)胞懸液中,混勻,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2-24小時(shí)。
6.加入4ml完全培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)24-72小時(shí).
7.倒掉培養(yǎng)基,藍(lán)光激發(fā)下觀察綠色熒光。
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8.項(xiàng)目完成。
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