一、技術(shù)簡介
Red基因重組技術(shù)，能使外源同源線性DNA片段快速與基因組DNA相應(yīng)基因同源重組，主要包括pKD46、pKD3、pCP20三個協(xié)助質(zhì)粒。pKD46質(zhì)粒由exo、beta、gam三個基因組成，它們分別編碼Exo、Beta、Gam三種蛋白質(zhì)，在一定濃度阿拉伯糖誘導(dǎo)下或誘導(dǎo)表達(dá)此三種蛋白。通過外源構(gòu)建同源線性片段，導(dǎo)入受體菌，在這三種蛋白的協(xié)助下與受體菌基因發(fā)生同源重組，最終實現(xiàn)基因的突變和缺失。同時pKD46質(zhì)粒是溫度敏感型質(zhì)粒，42°C條件下其會自動丟失。pKD3為克隆氯霉素抗性基因提供模板,與此同時在此質(zhì)粒中，Cm兩側(cè)有FRT位點，該位點能夠被FLP重組酶識別，當(dāng)重組酶存在時會將此位點之，間的片段進(jìn)行剪接，從而實現(xiàn)了Cm'去除，因此不僅為實驗進(jìn)行引入抗性標(biāo)記，方便了重組菌的篩選，更重要的是此抗性標(biāo)記會在因FRT位點的引入在需要時被酶切剔除。pCP20能夠表達(dá)FLP重組酶，進(jìn)而識別重組到基因組上的FRT位點，由此酶切掉兩位點之間引入的抗性基因片段片段，最終實現(xiàn)目的基因的缺失。pCP20同為溫敏型質(zhì)粒，培養(yǎng)條件高于42°C時自動丟失。
與Red同源重組基因敲除相關(guān)的3個酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一種核酸外切酶，單亞基的分子量為24 kD，Exo蛋白的活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子，中間有一中空的通道，通道的一端可容納雙鏈DNA分子，另一端只可容納單鏈DNA。Exo蛋白可結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從DNA雙鏈的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重組中起著決定性作用，具有介導(dǎo)互補單鏈DNA退火的功能，是一種退火蛋白，單亞基的分子量為25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，緊緊地結(jié)合在單鏈DNA的3’突出端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，并介導(dǎo)互補單鏈DNA的退火。雙鏈DNA退火完成后，Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來。
3、Gam蛋白：Gam蛋白為16kD的多肽分子，可與RecBCD核酸外切酶結(jié)合，抑制其對外源DNA的降解作用，防止外源DNA 進(jìn)入細(xì)胞后被宿主降解。
二、實驗步驟
1、制備pKD46/宿主菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)。
2、制備抗性基因打靶片段。
3、電轉(zhuǎn)，篩選陽性克隆。
4、導(dǎo)入PCP20質(zhì)粒消除抗性，無痕敲除。
三、相關(guān)質(zhì)粒（點擊可查看圖譜和序列）
pKD46，氨芐抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pKD46-Tet，四環(huán)素抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pKD20，氨芐抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pREDKI，卡那抗性，I-SceI,阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pKDsgRNA-ack 阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶，四環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄sgRNA
pREDCas9：攜帶針對氨芐基因的gRNA
pKD13，提供卡那霉素抗性重組模板
pKD4，提供卡那霉素抗性重組模板
pKD3，提供氯霉素抗性重組模板
pCP20：FLP重組酶消除抗性
四、參考文獻(xiàn)
[1] Datsenko KA1, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000,97(12):6640-6645.
[2] Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of lambda Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods. 2008,75(2):359-361. Doi: 10.1016/j.mimet.2008.06.010
