病毒細(xì)胞培養(yǎng)法及病變觀察

  細(xì)胞培養(yǎng)法是目前培養(yǎng)病毒應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)方法，其優(yōu)點(diǎn)是（1）經(jīng)濟(jì)適用，結(jié)果正確且敏感；（2）較實驗動物易于控制。細(xì)胞培養(yǎng)法多應(yīng)用于病毒的分離培養(yǎng)，進(jìn)行血清中和試驗及制造疫苗和抗原等方面。很多組織細(xì)胞，包括雞胚、鼠胚、各種動物的腎組織細(xì)胞，人胚羊膜組織細(xì)胞或流產(chǎn)胎兒組織細(xì)胞（應(yīng)在死后6 小時內(nèi)采取，因時間過長，組織細(xì)胞生長成功率下降）等均可作細(xì)胞培養(yǎng)的來源。

  細(xì)胞的選擇主要依據(jù)組織細(xì)胞對病毒的敏感性。能引起病變的組織細(xì)胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細(xì)胞。人類病毒，用人或猴的組織細(xì)胞較敏感，但這不是絕對的，如地鼠腎細(xì)胞較人腎細(xì)胞對流行性乙型腦炎病毒敏感。

（一） 原代細(xì)胞培養(yǎng)法

【材料】

9～10 日齡雞胚、Hanks 氏溶液、0.25％胰酶溶液、無菌小剪、鑷子、無菌培養(yǎng)皿、毛細(xì)吸管、吸管、沉淀管、無菌細(xì)胞培養(yǎng)管（抗生素空瓶）、100 毫升無菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗。

【方法】

1．用碘酒消毒雞胚蛋氣室外殼，并將它直立于蛋架上，以鑷子將雞胚取出放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，去頭爪及內(nèi)臟。

2．用小剪在培養(yǎng)皿內(nèi)將胚胎剪成小塊（4～5 毫米3），加Hanks 氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置1～2 分鐘后，用毛細(xì)吸管吸取液體。依同法再洗滌2 次，將血球充分洗去。

3．用鑷子將組織塊放入無菌玻璃瓶或三角燒瓶內(nèi)，加入10～15 毫升0.25％胰酶溶液，37℃水浴20 分鐘，中間搖動幾次。由于胰酶的作用可使大量細(xì)胞游離，液體變混。經(jīng)四層紗布過濾后的細(xì)胞懸液，低速離心沉淀（1000 轉(zhuǎn)/分以內(nèi)）5 分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營養(yǎng)液，用白細(xì)胞計數(shù)的方法進(jìn)行計數(shù)，使成每毫升含50～80 萬細(xì)胞懸液以作單層細(xì)胞培養(yǎng)。

4．每一細(xì)胞培養(yǎng)管，注入細(xì)胞懸液1 毫升，蓋好瓶塞，并將瓶略加搖動，橫臥于有槽木架上，使細(xì)胞均勻平鋪于管壁。置37℃溫箱孵育，一般4 小時，細(xì)胞附著于管壁，48 小時可長成單層，此時即可調(diào)換營養(yǎng)液，接種病毒。

（二） 傳代細(xì)胞培養(yǎng)法

從人及動物組織，特別是腫瘤組織，經(jīng)過多次傳代可建立傳代細(xì)胞系。這種細(xì)胞能無限地傳代，但并不是所有的組織細(xì)胞都能建立傳代細(xì)胞。有一些傳代細(xì)胞對病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。如HeLa 細(xì)胞，Hep－2 細(xì)胞及KB 細(xì)胞。HeLa 細(xì)胞對脊髓灰質(zhì)炎三型病毒，腺病毒及大多數(shù)實驗室適應(yīng)的ECHO 病毒都敏感。Hep－2 細(xì)胞也曾用來分離脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A 組病毒、腺病毒、RS 病毒。HeLa 細(xì)胞來自子宮頸癌，Hep－2 細(xì)胞來自喉癌，而KB 細(xì)胞來自上腭癌。由于傳代細(xì)胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學(xué)的研究而不能用于疫苗的生產(chǎn)。

【材料】

單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶，營養(yǎng)液，0.25％胰蛋白酶溶液，無菌吸管，無菌細(xì)胞瓶。

【方法】

1．將成片細(xì)胞的生長液倒掉，用Hanks 液洗一次。

2．加入適量的0.25％胰蛋白酶，37℃孵育1 分鐘。

3．將細(xì)胞瓶倒放，細(xì)胞在上，胰酶在下，繼續(xù)孵育37℃5～10 分鐘。

4．將胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生長液，用10 毫升吸管吹打分散細(xì)胞。

5．用生長液按原量3～4 倍稀釋，即一瓶細(xì)胞能傳3～4 瓶。

（三） 細(xì)胞培養(yǎng)接種病毒的方法及病變觀察

【材料】

單層細(xì)胞培養(yǎng)管、營養(yǎng)液、Hanks 溶液、無菌毛細(xì)滴管和腺病毒稀釋液。

【方法】

1．取已長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶二只，用無菌毛細(xì)滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。

2．用無菌的1 毫升吸管吸稀釋的腺病毒液0.1 毫升加入一只單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，另一只加0.1 毫升營養(yǎng)液不接種病毒作為對照，細(xì)胞瓶放平，使其接觸整個細(xì)胞層，置37℃作用1 小時，使病毒吸附到細(xì)胞上。

3．取出單層細(xì)胞瓶，每只中加入營養(yǎng)液0.9 毫升，蓋緊后置37℃孵箱中培養(yǎng)1～2 天。

4．取出細(xì)胞在低倍顯微鏡下觀察，注意種毒與對照二管的細(xì)胞形態(tài)，排列等。

注：為方便保存，此處觀察的細(xì)胞已經(jīng)過固定和染色。