免疫組化技術(shù)由于具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確的特點(diǎn)，對于疾病的診斷與鑒別診斷有著重要意義，當(dāng)免疫組化結(jié)果沒有出現(xiàn)預(yù)期的效果時(shí)，應(yīng)系統(tǒng)的分析和查找原因，找到有效的解決辦法。

      IHC實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，包括切片制作（固定，脫水，透明，包埋，切片，貼片，烤片），脫蠟，水化，阻斷，抗原修復(fù)，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，復(fù)染，封片和分析等，在上次的推文中向您介紹了切片制作和抗原修復(fù)兩個(gè)步驟中的常見問題及解析，本次為您帶來的是封閉和一抗孵育中的注意事項(xiàng)。文末還附有IHC通關(guān)的秘密武器——Bioss全新上市的IHC即用型試劑盒，助您一次獲得文獻(xiàn)級的圖像結(jié)果。

封閉

1.圖片背景值過高。

解決方法：①在使用抗體前采用溶于甲醇或水的3% H2O2或使用專門的試劑盒進(jìn)行淬滅，并使用堿性磷酸酶抑制劑，以減少內(nèi)源性過氧化物酶或磷酸酶的干擾；

②使用生物素類的二抗系統(tǒng)來檢測如腎臟和肝臟等富含生物素的組織樣本時(shí)，可以在一抗孵育前用親和素/生物素封閉試劑進(jìn)行封閉，以減少內(nèi)源性生物素活性的干擾；

③在加入抗體前把多余的緩沖液吸干，而非對組織樣品進(jìn)行洗滌，以減少來自內(nèi)源性酶的干擾；

④蛋白封閉時(shí)間不足導(dǎo)致背景增強(qiáng)甚至出現(xiàn)假陽性，應(yīng)選擇合適的封閉液，適當(dāng)延長封閉時(shí)間；

⑤所用血清溶血，應(yīng)選擇合適的封閉液。

2.染色結(jié)果呈假陰性。解決方法：①封閉時(shí)間過長導(dǎo)致陽性信號減弱甚至出現(xiàn)假陰性，應(yīng)選擇合適的封閉液，適當(dāng)減少封閉時(shí)間；②血清封閉液和一抗來源種屬相同，血清中的抗體可能和目的蛋白特異性結(jié)合了，進(jìn)而導(dǎo)致一抗沒有結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生假陰性。

3.目標(biāo)蛋白定位異常。解決方法：①熱滅活正常血清或BSA對組織進(jìn)行封閉孵育。

一抗孵育

1.圖片背景值過高。

解決方法：①抗體孵育后洗滌不充分，殘留抗體導(dǎo)致背景染色，建議增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)，延長浸洗時(shí)間。

2.染色結(jié)果過強(qiáng)。解決方法：①一抗?jié)舛冗^高是常見原因之一，可適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比；②一抗孵育溫度高，時(shí)間長，一般建議4℃過夜孵育，低溫雖然會(huì)使抗體結(jié)合緩慢，但特異性結(jié)合更好。

3.陽性檢測率及著色強(qiáng)度相對減弱，甚至無染色。解決方法：①抗體效價(jià)不高�？赏ㄟ^增加抗體使用濃度，延長抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整；②所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測試該抗體，以確�？贵w識(shí)別非變性抗原，或是選用通過IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體；③一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗；④抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境；⑤靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核時(shí)，建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入合適的滲透試劑，例如Triton X-100，以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。

4.染色結(jié)果呈弱陽性。解決方法：①適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比，或者選擇染色強(qiáng)度高，高親和力的抗體；②設(shè)置陽性組織切片的對照，因?yàn)橥�一蛋白在不同組織中的表達(dá)會(huì)有很大的差異；③切片在染色過程中抗體過濃或干燥了。切片上遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)；等于人為地對抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋，滴加試劑前應(yīng)盡量減少殘余液體。

5.染色結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色。解決方法：①可以通過調(diào)整抗體的稀釋比進(jìn)行改善，特異性強(qiáng)的抗體則不易受稀釋比的影響；②一抗?jié)舛忍�高，在使用新抗體前可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出最理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用；③孵育時(shí)間過長或孵育溫度過高，建議摸索不同抗體的最佳孵育條件；④一抗非特異性結(jié)合過高，可通過降低一抗?jié)舛然蚩s短孵育時(shí)間進(jìn)行改善；⑤一抗與實(shí)驗(yàn)組織同源，加入二抗后，二抗與組織結(jié)合。應(yīng)換與組織非同源的一抗；⑥一抗為多抗，建議更換為單克隆抗體；⑦抗體稀釋液中添加非離子型去污劑包括Triton X-100或Tween 20減少非特異性疏水相互作用。