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發(fā)布時間：2023/11/17 10:47:27 閱讀次數(shù)：247
分光光度法 50 管/24 樣
注 意 ：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細胞內(nèi)能量
代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。
測定原理：
乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD+還原生成NADH 和H+，H+傳遞給PMS
生成的 PMSH2 還原 INT 生成紅色物質(zhì)，在 530nm 處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽、離心機、可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制：
提取液：液體 55mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加入 1.5mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 15mL 蒸餾水充分溶解。
試劑五：粉劑×1 支，4℃避光保存。標準品：液體 1mL×1 支，4℃保存。
顯色液：臨用前根據(jù)用量按照提取液（V）：試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（m）=1（mL)： 0.3（mL)：3（mL)：15（mg）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少，在棕色瓶中配制，試劑盒中帶有 5 個棕色空瓶）
樣本處理：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL
提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，12000g 離心 10min，取上清測定。
2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；于 4℃，12000g 離心 10min，取上清測定。
3. 血清：直接測定。
測定操作：
|
| 樣品對照管 | 樣品測定管 | 標準對照管 | 標準測定管 |
| 樣品（μL） | 50 | 50 |
|
|
| 標準品（μL） |
|
| 50 | 50 |
| H2O（μL） | 300 | 450 | 300 | 450 |
| 試劑一（μL） | 150 |
| 150 |
|
| 試劑二（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 顯色液（μL） | 300 | 300 | 300 | 300 |
充分混勻，于 37℃反應(yīng) 30min，于 1mL 玻璃比色皿，蒸餾水調(diào)零，測定 530nm
處吸光值，分別記為 A1，A2，A3，A4，△A 樣=A2-A1；△A 標= A4-A3
注 意：標準對照管和標準測定管只需測定一次，每個樣品測定管設(shè)一個樣品對照管
計算公式：
1.按照蛋白含量計算：
LA 含量（μmol/mg prot）=△A 樣÷△A 標×C 標÷ Cpr
=2×△A 樣÷△A 標÷ Cpr
乳酸含量（lactic acid，LA）試劑盒說明書
2.按照樣本質(zhì)量計算
LA 含量（μmol/g 鮮重）=△A 樣÷△A 標×C 標÷ W
=2×△A 樣÷△A 標÷ W
3.按照細胞數(shù)量計算
LA 含量（μmol/104 cell）=△A 樣÷△A 標×C 標÷ 細胞數(shù)量
=2×△A 樣÷△A 標÷ 細胞數(shù)量
4.按照液體體積計算
LA 含量（μmol/mL）=△A 樣÷△A 標×C 標
=2×△A 樣÷△A 標
C 標：標準品濃度，2mmol/L ；W：樣本質(zhì)量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL
注意事項：
1.若吸光值超過 2，請進行適當?shù)南♂尯笤龠M行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2.最低檢出限為 1.8μmol/L。
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