Tregs小鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞培養(yǎng)說明書
一、細(xì)胞培養(yǎng)條件
二、細(xì)胞收到后處理
培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用 75%精噴灑整個(gè) 細(xì)胞瓶，消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴(yán)格無菌操作，將細(xì)胞瓶放入 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置 3-4 小時(shí)以穩(wěn)定 細(xì)胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好 40x,100x,200x
各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。（傳代后建議一瓶用原瓶的完全
培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基，以便進(jìn)行對比培養(yǎng)，換液后擰松瓶蓋）
三、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
細(xì)胞傳代：如果未超過 80%匯合度時(shí)，將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，留 5ml 完全培養(yǎng)基，放入 37℃、
5%CO2孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超 80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代具體步驟如下細(xì)胞傳代：
a、對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM 條件下離心 8-10 分鐘，棄上清液，補(bǔ)加 1-2ml 培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按
1:2 到 1:5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按 1:2 到 1:3 的比例分到 新的含 8ml 培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。
b、細(xì)胞凍存：
1、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 80%面積時(shí)，將 T25 培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中 1000rpm 離心 5min；
2、棄上清，沉淀細(xì)胞加入 1ml/支的雅吉生物無血清凍存液（C7001），混勻后加入凍存中。（如：凍一 支，加入 1ml 無血清凍存液即可）
3、將凍存細(xì)胞直接放入－80℃冰箱即可；如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，需在-80℃冰箱存 放 24 小時(shí)以上。
C、細(xì)胞復(fù)蘇： 產(chǎn)品名稱
Tregs 小鼠調(diào)節(jié) T 細(xì)胞
生長特性 懸浮 ，圓形
凍存條件 無血清凍存液
培養(yǎng)體系 DMEM+10%FBS+1%雙抗
傳代方法 建議 1:2 傳代
傳代情況 2~3 天換液/傳代
備注
懸浮細(xì)胞請離心收集，切勿直接倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液！ 用無菌離心管收集瓶子中培養(yǎng)基作過渡對比培養(yǎng)。 如果對比培養(yǎng)效果不好，建議直接購買完全培養(yǎng)基。切勿直接倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液。NO.YS2212C
1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié) 晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的 15ml 離心管中，1000rpm 離心 5min；
3、棄上清，沉淀用 5ml 完全培養(yǎng)基重懸，接種至 T25 培養(yǎng)瓶，放于 37℃,5%CO2細(xì)胞養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4、第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
四、注意事項(xiàng)：該細(xì)胞難養(yǎng)，收到細(xì)胞可按以下方法操作：
半換液處理，豎著培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱靜置 1 小時(shí)左右，輕輕吸掉 3ml 左右培養(yǎng)基然后補(bǔ)給 3ml 的完全
培養(yǎng)基，如果培養(yǎng)基變色慢，可直接加 500ul 左右 FBS，傳代的時(shí)候可以直接給 5ml 培養(yǎng)基，分兩個(gè)培 養(yǎng)瓶培養(yǎng)，一般這樣傳代 3 次左右可以離心傳代一次，掉死細(xì)胞
五、售后服務(wù)告知書
1）細(xì)胞出現(xiàn)問題，可重發(fā)的情況有哪些？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么？
1. 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問題，細(xì)胞丟失、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā)；
2. 細(xì)胞污染問題，請?jiān)谑盏疆a(chǎn)品 48 小時(shí)內(nèi)，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，核實(shí)后重發(fā)；
3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置 24 小時(shí)后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后 24 小時(shí)后，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活，（需提
供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片），重發(fā)；
4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后 24 小時(shí)后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置 4 小時(shí)候并且未開封，出現(xiàn)污染，重發(fā)；
5. 細(xì)胞活性問題，請?jiān)谑盏疆a(chǎn)品 7 天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用臺盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力，核實(shí) 后予重發(fā)；
6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第 2,3 天請拍照，3 天未告知的，視為產(chǎn)品合格。4-7 天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細(xì)胞 前 3 天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題時(shí)照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的，并跟技術(shù)人員溝通的，由技術(shù)人員判 定為我方責(zé)任的，重發(fā)。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價(jià)的 50%收費(fèi)重 發(fā)。
二）細(xì)胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些？
1. 客戶造成細(xì)胞污染，不重發(fā)；
2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；
3. 非本庫推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；
4. 細(xì)胞狀態(tài)不好，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前 3 天照片的，不重發(fā)；
5. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理的，不重發(fā)；
6. 細(xì)胞收到 2 天內(nèi)，未告知，不重發(fā)；
7. 視具體情況而定。
