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發(fā)布時間:2024/9/6 13:09:27 閱讀次數(shù):140
(酶聯(lián)免疫法)
1 原理及用途
赭曲霉毒素是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物。其中赭曲霉毒素A在自然界分布最廣,毒性最強(qiáng),對人類和動植物影響最大。
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測米面、花生、大豆等谷物及飼料樣本中的赭曲霉毒素(Ochratoxins A,OTA),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的赭曲霉毒素和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗赭曲霉毒素抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含赭曲霉毒素含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中赭曲霉毒素的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度:1ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式:37℃,30min~30min~15min
2.3 檢測下限:
谷物…………………………5ppb
飼料…………………………10ppb
2.4 交叉反應(yīng)率:
赭曲霉毒素A…………………………………100%
2.5 樣本回收率:
谷物及配合飼料…………………………85%±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)品(黑蓋):各1ml
0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb
酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………11ml
抗體工作液(藍(lán)蓋)………………5.5ml
底物液A(白蓋)……………………6ml
底物液B(黑蓋)……………………6ml
終止液(黃蓋)………………………6ml
20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)
4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知:
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液:
配液1:70%甲醇
V甲醇:V水=7:3(7份甲醇加3份去離子水)。
配液2: 0.1M碳酸氫鈉溶液
稱取4.2g碳酸氫鈉,加入去離子水混勻溶解,定容至500ml。
配液3: 工作洗滌液
滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟:
5.3.1 食品類谷物、大豆類(大米、玉米、小米等)處理方法
1)稱取4g粉碎樣品于50ml離心管中,加10ml 70%甲醇,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取1ml上清,加入1ml 0.1M碳酸氫鈉溶液,振蕩;
3)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):5 檢測下限:5ppb
5.3.2飼料處理方法
1)稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中,加10ml 70%甲醇,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;
2)取1ml上清,加入1ml 0.1M碳酸氫鈉溶液,振蕩;
3)取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):10 檢測下限:10ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
6.1 編 號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加抗體工作液50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
6.4 加酶反應(yīng):加酶標(biāo)記物100µl/孔,37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗 滌:同上
6.6 顯 色:加底物液A 50µl/孔,再加底物液B 50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,37℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時間)。
6.7 終 止:加終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)= | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索取)
8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位(A450nm< 0.5 )時,表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。
保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。
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