質(zhì)粒大抽后,通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右,可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。但是如果想得到高濃度的質(zhì)粒,可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質(zhì)粒。
加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質(zhì)粒中加入0.7毫升異丙醇),混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘,小心吸去上清液,避免觸及沉淀。
如果希望獲得較高濃度的質(zhì)粒,在洗脫時(shí)推薦采用1毫升洗脫液進(jìn)行洗脫,后續(xù)可以轉(zhuǎn)移到2毫升離心管內(nèi)進(jìn)行異丙醇沉淀,這樣操作起來相對比較方便。異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀,和乙醇沉淀產(chǎn)生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔,避免沉淀松動(dòng)或部分顆粒狀懸浮至溶液中。不推薦直接倒棄上清,直接倒棄上清時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)直接把質(zhì)粒沉淀倒掉的情況;如果偏好直接倒棄上清,建議把上清倒棄至一潔凈離心管內(nèi),這樣萬一沉淀被倒出,仍然可以從潔凈離心管中回收。推薦用移液槍吸去上清,并注意盡量避免吸走沉淀。
加入1毫升常溫70%乙醇溶液,輕輕懸起質(zhì)粒沉淀以充分洗滌,12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘,小心吸去上清液,避免觸及沉淀。
5,000-10,000rpm 4℃離心5-10秒,用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體,避免觸及沉淀。
肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內(nèi)即可完成干燥),加入適當(dāng)體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q級純水)溶解DNA。
DNA樣品不能過于干燥,否則很難溶解。最好在弱堿性條件下溶解DNA,溶解時(shí)可用緩沖液反復(fù)沖洗管壁,使管壁上的DNA充分溶解。