一、Exosome簡(jiǎn)介

       最近幾年，一種叫做Exosome的小囊泡正受到大家廣泛的關(guān)注。Exosome是直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。Exosome天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌體(Exosome) 是活細(xì)胞分泌的來(lái)源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體 )的膜性囊泡。

       Exosome在30年前被人們所發(fā)現(xiàn)。早期的研究認(rèn)為，exosome執(zhí)行蛋白運(yùn)輸功能，特異靶定受體細(xì)胞，交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號(hào)事件。直到2007年，研究人員發(fā)現(xiàn)exosome也運(yùn)輸核酸，參與細(xì)胞間通訊�？傊�，其蛋白、RNA和脂肪成分特異，且攜帶了一些重要的信號(hào)分子，有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用，這使得exosome的市場(chǎng)也在快速擴(kuò)展，并成為熱門的研究對(duì)象。

      不同組織細(xì)胞來(lái)源exosome由于攜帶的蛋白質(zhì)不同，而能夠發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。例如，腫瘤細(xì)胞分泌的exosome能夠介導(dǎo)血管再生腫瘤細(xì)胞增殖及免疫逃逸；而樹(shù)突狀細(xì)胞源性exosome則能夠引起機(jī)體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn)，Exosome內(nèi)含有與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的蛋白質(zhì)rRNA和microRNA，并且exosome能夠通過(guò)生物屏障，在細(xì)胞間傳遞功能性核酸分子，從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能，故exosome有望成為一種新型給藥途徑及基因治療載體。

      Exosome攜帶蛋白質(zhì)包括源細(xì)胞非特異性和源細(xì)胞特異性兩類蛋白分子。前者可能與exosome的生物發(fā)生和生物學(xué)作用有關(guān) ，主要包括：細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白；另一類是特殊蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)只存在于某種特殊的細(xì)胞分泌 的exosome，而這些特定細(xì)胞源的exosome與其生物學(xué)功能有著密切聯(lián)系，例如分子來(lái)源的Exosome上含有MHCII類分子。

二、Exosome提取

      Exosome是由活細(xì)胞分泌的，它是一種亞細(xì)胞成分，組要成分是磷脂雙分子和攜帶的膜性分子，其界定依據(jù)形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)及提取方式不同細(xì)胞源的exosome是不同的，這些不同的理化性質(zhì)有利于exosome的提取。從體外培養(yǎng)的細(xì)胞中分離和提取exosome的主要方法是高速離心法，這種方法能分離出大的碎片和已經(jīng)死亡細(xì)胞， 然后再通過(guò)超速離心法分離 提取exosome 最后利用糖梯度，使脂質(zhì)囊性質(zhì)的exosome漂浮于上面。

      具體來(lái)說(shuō)，exosome的研究方式是分離/捕獲小囊泡，并拷問(wèn)它所攜帶的貨物。就目前而言，人們多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過(guò)濾的方法，對(duì)exosome進(jìn)行前期的分離。之后利用電鏡來(lái)分析其大小和形態(tài)，利用流式細(xì)胞儀來(lái)分析細(xì)胞表面標(biāo)記，通過(guò)Western blot和ELISA等方法對(duì)蛋白進(jìn)行分析，或通過(guò)qPCR和新一代測(cè)序（NGS）來(lái)分析RNA。

      調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在分離exosome時(shí)，約有56%的人采用超速離心法，說(shuō)明這種方法仍是目前的金標(biāo)準(zhǔn)方法。不過(guò)，生物通之前也介紹過(guò)，這種方法缺點(diǎn)也不少：耗時(shí)耗力，往往需要8-30個(gè)小時(shí)；每次最多只能處理6個(gè)樣品；需要大量的起始材料；產(chǎn)量不高。商業(yè)化的exosome提取試劑盒已經(jīng)上市，更為簡(jiǎn)單省事。

1.超速離心法

       將欲提取的細(xì)胞培養(yǎng)上清液10ml，在4 ℃的環(huán)境下，300×g 10min ，2000×g 20min，棄沉淀，去除細(xì)胞；然后 l0,000×g 30min ，棄沉淀，去除亞細(xì)胞成分；再用10,000×g 60min，棄掉上清液，最后所得沉淀既為exosome ，用30ml PBS 溶液重新懸浮沉淀物，混勻后再以10,000×g 60min，用 l ml PBS溶液懸浮沉淀物提純的exosome 溶液分別裝入eppendorf 管內(nèi)，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/span>

2.磁珠

      超速離心法既耗時(shí)又費(fèi)力�，F(xiàn)在您可以通過(guò)使用靈活可控的總外泌小體分離試劑，從不同的起始樣本中方便地富集完整的外泌小體。這些試劑及其配套的試驗(yàn)方案完美適用于廣泛的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，包括小輸入樣本量和多種樣本處理實(shí)驗(yàn)。

      從培養(yǎng)細(xì)胞中富集的總外泌小體（使用總外泌小體分離試劑或超速離心）可以通過(guò)免疫磁性捕獲法進(jìn)一步純化為亞組分�？墒褂没�于Dynabeads?的CD63特異性試劑，或?qū)㈡溍褂H和素試劑與特定的生物素化抗體結(jié)合使用，可基于表面抗原的免疫反應(yīng)純化得到任何所需的亞組分。

三、Exosome分析

      在下游分析方面，分離純化出來(lái)的exosome可以做蛋白，也可以做RNA（microRNA和LncRNA），36%的研究人員通過(guò)Western blot或其他方法來(lái)鑒定蛋白，29%的人員利用qPCR對(duì)microRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，9%利用芯片進(jìn)行microRNA表達(dá)譜分析。同時(shí)，新一代測(cè)序的用戶也不少，13%的人員利用NGS開(kāi)展microRNA/小RNA研究，9% 開(kāi)展mRNA研究。此外，目前的大部分工作還是停留在科研階段，后續(xù)的生物標(biāo)志物開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證不多，而診斷和療法的開(kāi)發(fā)就更少。Razvi認(rèn)為，exosome的定性和定量研究是個(gè)快速發(fā)展的市場(chǎng)。同時(shí)，循環(huán)生物標(biāo)志物的市場(chǎng)也存在著機(jī)遇和挑戰(zhàn)。不過(guò)，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的成功讓人們相信，循環(huán)生物標(biāo)志物有望在腫瘤及其他疾病的診斷上發(fā)揮作用。

1.蛋白分析

（1）SDS-PAGE

通過(guò)SDS-PAGE電泳可以分析得到的Exosome中蛋白的含量及種類。

（2）Western-Blot

通過(guò)Western-Blot可以檢測(cè)Exosome中特定的蛋白表達(dá)情況。

（3）2-DE等蛋白組學(xué)分析

可以了解Exosome中不同蛋白的表達(dá)、數(shù)量情況

2. 透射電鏡

通過(guò)透射電鏡可以分析Exosome的大小、形態(tài)等，再結(jié)合免疫標(biāo)記可以很清楚的分析特定指標(biāo)在Exosome表達(dá)的部位。

3.基因水平

（1）Real-Time PCR

通過(guò)PCR可以分析需要研究的指標(biāo)的表達(dá)量

（2）轉(zhuǎn)錄組分析

通過(guò)測(cè)序或者芯片，分析Exosome不同基因的轉(zhuǎn)錄水平

（3）miRNA 

通過(guò)測(cè)序或者芯片，檢測(cè)與Exosome相關(guān)的miRNA的表達(dá)情況，研究特定的miRNA

（4）lncRNA分析

通過(guò)測(cè)序或者芯片，檢測(cè)與Exosome相關(guān)的lncRNA的表達(dá)情況，研究特定的lncRNA與Exosome共同調(diào)控某種疾病的關(guān)系

四、Exosome中RNA的分離

1.切體隔離

增長(zhǎng)切體無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞。因此，任何血清細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的外來(lái)應(yīng)耗盡120萬(wàn)個(gè)晚上XG離心在4 ° C后才能使用。

將細(xì)胞懸液錐形管。

在4 ° C沉淀細(xì)胞，離心10分鐘300 XG。

轉(zhuǎn)移上清超速離心機(jī)管，如果不徹底全面加入PBS。

樣品16 500 XG離心20分鐘，4 ° C至進(jìn)一步去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。

通過(guò)0.2微米過(guò)濾除去大于200納米的顆粒過(guò)濾上清液。

過(guò)濾上清液轉(zhuǎn)移到新的超速離心機(jī)管和120 000 XG 70分鐘前，超速離心機(jī)密封管在4 ° C至顆粒的外來(lái)體。

棄上清。

最大的外切體檢索，懸浮切體充實(shí)ED顆粒多次在一個(gè)適當(dāng)?shù)木彌_體積�。�?3 × 50μL）。這個(gè)緩沖區(qū)取決于以下的切體隔離計(jì)劃的下游實(shí)驗(yàn)。例如，裂解液用于蛋白質(zhì)和RNA的分離，PBS是用于電子顯微鏡和流式細(xì)胞儀和功能的研究介質(zhì)可能是首選。

注;外來(lái)體也可以從不同的體液，如血漿，使用相同的過(guò)程，作為細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。對(duì)于粘性液體，它可能是必要的，用PBS稀釋的樣品離心和過(guò)濾步驟之前的。在上述5點(diǎn)的離心速度，它可以增加至29 500 XG，第7點(diǎn)中的離心可以延長(zhǎng)至90分鐘18。

如果樣品需要進(jìn)一步純化的外切體顆�？善�浮在蔗糖梯度和外來(lái)將主要分?jǐn)?shù)representing一個(gè)密度1.13-1.19克/毫升2。

2.切體識(shí)別電子顯微鏡

為了進(jìn)一步消除污染蛋白，重懸在120 000 XG 70分鐘，在4 ° C至重新沉淀外來(lái)的外切體的豐富沉淀，PBS和超速離心機(jī)。

的蛋白分離和總蛋白測(cè)定樣品的小等分。確保只有一小部分樣品裂解和蛋白質(zhì)測(cè)量，并保存完整的外來(lái)體，解決的PBS，單獨(dú)的冰或在-80℃為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

將在PBS重懸的完整的外來(lái)exosomal蛋白質(zhì)約10微克，一個(gè)下降，一個(gè)封口膜。然后，用血管鉗，輕輕的位置上每一滴30-60分鐘的頂部formvar碳包覆鎳網(wǎng)格。保證網(wǎng)格定位涂層的一面面臨下降含外來(lái)。

將三滴，每30μL的PBS，在T他封口膜和洗網(wǎng)格，按順序定位的PBS液滴上的電網(wǎng)和使用吸油紙之間。使用吸油紙輕輕只是抱著它不涂面積接觸，密切合作，以電網(wǎng)側(cè)。

修復(fù)存款樣品的封口膜下降了2％多聚甲醛，并放置在頂部的10分鐘下降的網(wǎng)格。

重復(fù)洗滌步驟中的第4點(diǎn)，前一個(gè)合適的抗體免疫。常用的抗體是抗CD63和抗MHCⅡ類。電子顯微鏡也可以不免疫作為外來(lái)體的大小和形態(tài)上，完全可以識(shí)別基于。但是，我們建議，評(píng)估的大小，形態(tài)和為一個(gè)更確鑿的驗(yàn)證的膜蛋白的存在。

網(wǎng)格傳輸選擇的主要抗體30μL下降，孵育40分鐘。洗凈重復(fù)第4點(diǎn)，但在PB中使用0.1％的牛血清白蛋白S代替的PBS單獨(dú)。

重復(fù)第7點(diǎn)，但與10納米金標(biāo)記的第二抗體和單用PBS洗。

修復(fù)后下降了2.5％戊二醛中加入的封口膜樣品，孵育10分鐘下降頂部的網(wǎng)格。重復(fù)第4點(diǎn)的洗，但使用去離子水液滴，而不是三個(gè)水滴的PBS。

對(duì)比樣品加入下降2％醋酸鈾的封口膜，下降為15分鐘的頂部，并培育網(wǎng)格。

嵌入下降了0.13％甲基纖維素和0.4％的醋酸鈾的封口膜樣品，孵育10分鐘下降頂部的網(wǎng)格。

刪除多余的液體，然后輕輕地使用吸油紙的定位與涂邊格在一張紙上，讓空氣干燥5分鐘。

用電子顯微鏡檢查的籌備工作，或存儲(chǔ)在網(wǎng)格中的電網(wǎng)，為今后的工作。

3.由流式細(xì)胞儀的外切體的表征

作為外來(lái)太小，由目前的流式細(xì)胞儀設(shè)備檢測(cè)，有必要先綁定外來(lái)抗體包被的磁珠（ 圖1） 。這些珠子可以購(gòu)買一個(gè)現(xiàn)成的產(chǎn)品，或選擇的抗體在實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)exosomal細(xì)胞來(lái)源，不同的抗體可以配上珠可以磁或乳膠字符。我們目前使用的抗MHC II類或抗CD63的包被的磁珠這種分析。

對(duì)于使用“國(guó)產(chǎn)”的抗體包被的磁珠，我們使用4微米乳膠具有抗CD63抗體包被的磁珠。 25μL4微米乳膠珠（30 × 10 6珠）100μL的MES緩沖的兩倍，3 000 XG 15-20分鐘，洗凈，在100μL的MES緩沖溶解沉淀。準(zhǔn)備抗體的混合物，其中包含一個(gè)體積等于12.5微克抗體與相同體積的MES緩沖。添加珠抗體的混合物，在室溫下孵育過(guò)夜攪拌�？贵w包被的磁珠洗凈，用PBS（3 000 20分鐘XG）三次沉淀溶于100μL存儲(chǔ)緩沖區(qū)（與終濃度為300 000珠/μL）。

對(duì)于每個(gè)樣本（每個(gè)抗體），繼續(xù)與卷等于30微克exosomal蛋白質(zhì)的最低％?100 000抗體包被珠（PBS中解決了完整的外來(lái)）。

孵育外來(lái)珠，在一個(gè)總體積300μLPBS過(guò)夜，在4 ° C下輕柔的動(dòng)作。

加入300μL200毫米甘氨酸和孵化30分鐘座。

兩次洗滌緩沖液的切體珠復(fù)合物（1-3％血清的PBS），10分鐘600 XG洗凈。

孵育50μLIgG抗體的外切體珠復(fù)合物4 ° C。在洗滌緩沖液洗凈切體珠復(fù)合物，在第5步中所述的兩倍。

添加90μL洗滌緩沖液和10μL抗體的選擇（理想的抗CD9，抗CD63或CD81的反）的切體珠復(fù)合物和40分鐘，輕柔的動(dòng)作下孵育。在洗滌緩沖液的切體珠復(fù)合物在第5步中所述的兩次洗凈。

加入300μl洗滌緩沖液，并用流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)。

如上所述，不同的珠子可以使用，如協(xié)議或磁珠所述的乳膠珠。如果用來(lái)代替磁珠，請(qǐng)注意，該協(xié)議是略有不同。阻塞步驟（4點(diǎn)）是不是必需的，是由放置在一個(gè)磁性的立場(chǎng)，而不是一個(gè)離心管進(jìn)行洗。

“自制”的抗體包被的磁珠使用的存儲(chǔ)緩沖區(qū)，包含0.1％甘氨酸和azid在PBS，pH值7.2，0.1％鈉。

更重要的是，確保使用流式細(xì)胞儀洗滌緩沖液（1-3％血清的PBS）外切體耗盡血清，以避免任何血清外來(lái)污染分析。

請(qǐng)注意，使用抗體加上珠的切體的表征時(shí)，重要的是要承認(rèn)，這僅僅是一個(gè)特定的亞群，特定于所使用的抗體，即分離并鑒定。

4.切體檢測(cè)用Western blot

Western印跡是一個(gè)行之有效的方法，我們不會(huì)細(xì)講就方法本身，但重點(diǎn)放在一個(gè)合適的蛋白分離前的印跡和使用不同的抗體的重要性。

溶解蛋白裂解液的選擇外切體顆粒，并徹底吹打，旋渦混合。要進(jìn)一步裂解的外來(lái)體，超聲水浴中3 × 5分鐘之間的旋渦混合樣品。最后，在室溫下5分鐘離心樣品13 000 XG，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的Eppendorf管。

Measu重新選擇的方法總蛋白和負(fù)載20-50微克的蛋白質(zhì)，每口井。

凝膠電泳和電泳分離和轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。

座和洗膜，然后再執(zhí)行對(duì)在外來(lái)豐富的蛋白質(zhì)免疫。

檢測(cè)化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像系統(tǒng)和分析軟件的特定蛋白質(zhì)。

至于有沒(méi)有切體的特異性標(biāo)志物，在外來(lái)豐富的蛋白質(zhì)，從各個(gè)不同的細(xì)胞起源，是常用的外切體檢測(cè)。這些tetraspanins（如CD9，CD63和CD81），細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（如ezrin）和多泡的生物合成（如TSG101和ALIX）涉及的蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)。其他蛋白質(zhì)也常用于外來(lái)檢測(cè)Flotillin，HSC70和不同的Rab蛋白等，但也有特定的蛋白質(zhì)，如A33（腸上皮細(xì)胞）的外來(lái)細(xì)胞中CD3（T細(xì)胞）和MHCⅡ類（抗原呈遞細(xì)胞）。因此，根據(jù)外來(lái)體是由什么類型的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)記發(fā)布可能會(huì)有所不同。

由于其他車廂的細(xì)胞也能產(chǎn)生水泡，這是進(jìn)一步建議，以確定這些車廂，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（如calnexin和GRP78）和高爾基體（如GM130）的蛋白質(zhì)的存在。因此，這些蛋白質(zhì)的缺乏表示沒(méi)有或很少污染樣品中的其他車廂的囊泡研究。

5. exosomal RNA和RNA分析的分離

切體顆粒溶解在RNA裂解液的選擇和執(zhí)行RNA的提取。根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)不同的RNA分離試劑盒可用于，但基于列的方法提供了更廣泛的RNA樣品。目前，我們正在使用由Exiqon miRCURY RNA分離試劑盒，但可能適合在SC上其他套件ientific問(wèn)題就在眼前。

在進(jìn)行RNA的分離是很重要的工作在無(wú)RNase的環(huán)境。因此，使用核酸和核酸免費(fèi)槍頭和擦拭工作臺(tái)和設(shè)備，無(wú)污染物和核糖核酸酶。

RNA的提取，使用miRCURY RNA提取試劑盒，溶于350μL裂解液的切體顆粒，并執(zhí)行旋渦混合15秒。

加入200μl95％乙醇和10秒的旋渦混合的。

放置在一個(gè)收集管一列，并轉(zhuǎn)移裂解外來(lái)列和離心1分鐘14 000 X G.

包含exosomal RNA和離心1分鐘14 000 X G.列加入400μL洗滌液洗三次

離心2分鐘14 000 XG，以確保該列是干的，并放置在一個(gè)無(wú)RNase Eppendorf管干欄列。

加入50μL洗脫液列和2型離心機(jī) 200 XG分鐘，其次是1分鐘14 000 X G.

繼續(xù)分離出的RNA，或存放在-80 ° C。