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發(fā)布時(shí)間：2020/9/30 11:24:04 閱讀次數(shù)：2020
LMH雞肝癌細(xì)胞
培養(yǎng)說明書
一 細(xì)胞培養(yǎng)條件
| 英文名稱 | LMH | 中文名稱 | 雞肝癌細(xì)胞 |
| 生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液 |
| 培養(yǎng)體系 | DMEM/F12+10%特級(jí)FBS,細(xì)胞貼壁性差,補(bǔ)液的時(shí)候不要沖刷到細(xì)胞層,2-3天換液,90%以上匯合度傳代,傳代比例1：3-1：6,每隔2-3天傳代 | ||
| 傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
| 備注 | 用無菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基,留作過渡培養(yǎng) | ||
二 細(xì)胞收到后處理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖詈棉k法.收到細(xì)胞回到自己的實(shí)驗(yàn)室后,先打開外包裝,用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi),嚴(yán)格無菌操作,培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí).鏡下觀察：未超過80%匯合度時(shí),可將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,加入6ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時(shí),根據(jù)情況傳代或者凍存,具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟.（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）
三 細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入5mL培養(yǎng)基混合均勻.在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻.然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中）,培養(yǎng)過夜.第二天換液并檢查細(xì)胞密度.
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng).
1 對(duì)于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次.
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化.
3.輕輕吹打細(xì)胞,完全脫落后吸出,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻.
4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液,將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中.
PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞,收到細(xì)胞后,用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi),嚴(yán)格無菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,加入5ml左右完全培養(yǎng)基混勻,放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%,換液繼續(xù)培養(yǎng),視情況傳代或者凍存.若密度超過80%,可直接進(jìn)行傳代（方法同上）.
3）細(xì)胞凍存：
1 細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次；2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心5min；
3 用適量的凍存液重懸細(xì)胞,并放置于凍存管中；
4 先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,然后將其移入-80℃.
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