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發(fā)布時(shí)間：2023/3/17 9:35:21 閱讀次數(shù)：428
| 基于自身分子酶進(jìn)化技術(shù)平臺(tái)（In silico Design & in vitro Evolution Workflow）,并持續(xù)聚焦LAMP恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),全新升級(jí)的Bst4.2系列,將LAMP擴(kuò)增技術(shù)推入了新的高度.熱啟動(dòng)Bst4.2系列在保持Bst4.0 通擴(kuò)的能力的基礎(chǔ)上,全系包含熱啟動(dòng)Aptamer,該配體確保酶在<30℃時(shí),酶活封閉效率>95%,在>60℃時(shí)1min內(nèi)酶活完全釋放.現(xiàn)階段,熱啟動(dòng)HotStart Bst4.2 Polymerase為已知的LAMP擴(kuò)增最佳用酶,與普通LAMP擴(kuò)增體系相比它有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì). | ||||||||||||
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實(shí)例性能展示 | ||||||||||||
| 1 Bst 4.2熱啟動(dòng)性能展示 采用熒光酶活測(cè)定法在30℃和60℃條件下測(cè)定HotStart Bst 4.2,結(jié)果顯示與未加入Aptamer的對(duì)照比較來看.HotStart Bst 4.2在30℃條件下酶活幾乎無活性,而60℃條件下1min內(nèi)酶活完全釋放,恢復(fù)100%活性. | ||||||||||||
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| 2 以Bst 4.2 SYBR Green試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LAMP和eLAMP擴(kuò)增比較 以human Total RNA為模板,采用RnaseP LAMP Primer進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LAMP和eLAMP 擴(kuò)增.在25ul擴(kuò)增體系中加入10ng 1ng和0ng的RNA,70℃反應(yīng)40min.從擴(kuò)增結(jié)果可獲得,在Helicaser的加持下F3/B3可完全去除,對(duì)擴(kuò)增速度幾乎無影響,并且非特異性擴(kuò)增得到改善. 6 Primer LAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM; F3/B3=0.1 μM. 4 Primer eLAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM. | ||||||||||||
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| 3 以Bst 4.2 Basic試劑進(jìn)行DP-eLAMP探針法擴(kuò)增 在眾多的探針法LAMP測(cè)試中,DP-LAMP探針法（Displaceable Probe LAMP）為推薦的使用方法（參考PMID: 33626039）.在LAMP擴(kuò)增中將LF或LB引物退火至互補(bǔ)的猝滅oligo,利用鏈置換活性獲得游離的熒光信號(hào)（可參考3831-21說明書資料）.該方案可進(jìn)一步降低LAMP的非特異擴(kuò)增.下圖為DP-eLAMP進(jìn)行三種熒光標(biāo)記探針的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).結(jié)果顯示HotStart Bst4.2總能獲得高特異性和高重復(fù)性的擴(kuò)增. | ||||||||||||
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| 4 以Bst4.2 L-HNB 試劑進(jìn)行L-HNB （紫羅蘭-淡綠） 變色反應(yīng)（肉眼觀察） 以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,采用eLAMP擴(kuò)增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對(duì)10000 1000 100 25copies/管的陽性RNA進(jìn)行檢測(cè),ddH20為陰性對(duì)照（4重復(fù)）.下圖為70℃反應(yīng)30min 后的檢測(cè)結(jié)果.結(jié)果表明L-HNB法獲得清晰易于區(qū)分的顏色變化,極易區(qū)分陽性和陰性擴(kuò)增. | ||||||||||||
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| 5 以Bst4.2 L-HNB （紫羅蘭-淡綠） 變色反應(yīng)對(duì)反應(yīng)緩沖鹽Tris的耐受性測(cè)試 以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,采用eLAMP擴(kuò)增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對(duì)1000copies/管的陽性RNA進(jìn)行檢測(cè)（2重復(fù)）,ddH20為陰性對(duì)照（2重復(fù)）.下圖為70℃反應(yīng)30min 后的檢測(cè)結(jié)果.結(jié)果表明L-HNB法,在1x濃度下可耐受10mM Tris-HCl的緩沖鹽,陽性樣本仍然可以充分的變色.該變色方法不受樣本中緩沖鹽影響. | ||||||||||||
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| 6 以Bst4.2 Red試劑進(jìn)行LAMP紅黃變色擴(kuò)增 以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,1-6分別為1 10 100 1000 104和106Copy,NTC為ddH2O為模板.上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前,下圖為70℃反應(yīng)30min后. | ||||||||||||
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| 7 以Bst 4.2 Basic試劑搭配 OG 橙綠變色反應(yīng)管（A3821） 以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,1-6分別為1 10 100 1000 104和106Copy,NTC為ddH2O為模板.上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前,下圖為70℃反應(yīng)30min后. | ||||||||||||
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