細胞培養(yǎng)物污染往往是細胞培養(yǎng)實驗室中最常見的問題,有時會造成非常嚴重的后果.細胞培養(yǎng)污染物可分為兩大類,一類是化學污染物,如培養(yǎng)基 血清和水中的雜質,包括內毒素 增塑劑和洗滌劑,另一類是生物污染物,如細菌 霉菌 酵母 病毒和支原體,以及其他細胞系的交叉污染.雖然污染無法完全消除,但可以通過全面了解其來源并遵循良好的無菌技術來降低污染的發(fā)生頻率和嚴重性.這里將概述主要的生物污染類型.

細菌是一大類普遍存在的單細胞微生物.細菌的直徑通常只有幾微米,其形狀多樣,如球狀 桿狀和螺旋狀等.由于分布廣泛 生長迅速和體積大小等特點,細菌以及酵母和霉菌是細胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物.細菌污染在培養(yǎng)物感染后幾天內就很容易被肉眼觀察到；受感染的培養(yǎng)物通常會變得渾濁,有時表面會有一層薄膜.經(jīng)常還會出現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然下降的情況.在低倍顯微鏡下,細菌以細小顆粒的形式出現(xiàn)在細胞之間,在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個細菌的形狀.下面的模擬圖像顯示了貼壁培養(yǎng)的293細胞被大腸桿菌污染.

酵母是真菌界中的單細胞真核微生物,大小從幾微米（常見）到40µm（罕見）不等.與細菌污染一樣,被酵母污染的培養(yǎng)物會變得混濁,尤其是在污染的后期.被酵母污染的培養(yǎng)物,其pH值幾乎沒有變化,通常直到污染嚴重時,pH值才會升高.在顯微鏡下,酵母呈單個卵球形或球形顆粒,可能還會出芽產(chǎn)生更小的顆粒.下面的模擬圖像顯示了貼壁293細胞鋪板24小時后被酵母感染的情況.

黑膠蟲是一種生物還是非生物,學術界至今還有爭議.這里我們暫且將其認作是一種微生物.黑膠蟲污染主要來源于血清.黑膠蟲的出現(xiàn)常在培養(yǎng)條件改變 細胞接種密度降低 細胞狀態(tài)不佳時顯現(xiàn)并使實驗中斷,尤其在凍存細胞復蘇時可造成大量細胞死亡.黑膠蟲生長與細胞的生長有此消彼長的關系,即當細胞狀態(tài)好時小黑點會相應的減少；反之則增加,似乎有細胞競爭生長的關系.

黑膠蟲污染的特點是起初對細胞并無影響,當達到一定數(shù)量時則會影響細胞生長.受黑膠蟲污染的細胞液通常清亮無變化,在高倍顯微鏡下可以觀察到點狀片狀的游動小體,做布朗運動.

支原體是最小的（0.3 μm）能夠自我復制的有機體,倒置顯微鏡下通常觀察不到.支原體沒有細胞壁,對常用的抗生素不敏感.支原體感染是極為不易察覺的,可能直到出現(xiàn)了可以觀察到的病變或發(fā)現(xiàn)細胞正常功能喪失的時候,才意識到是發(fā)生了支原體感染.一些生長緩慢的支原體可在培養(yǎng)物中持續(xù)存活,而不會導致細胞死亡,但它們可以改變培養(yǎng)體系中宿主細胞的行為和代謝.慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細胞增殖率降低 飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；但是,檢測支原體污染的唯一可靠方法是通過使用熒光染色（例如Hoechst33258染色） ELISA PCR 免疫染色 放射自顯影或微生物測定法定期檢測培養(yǎng)物.

霉菌是真菌界的真核微生物,以多細胞絲狀體生長,稱為菌絲.這些多細胞絲狀體構成的交聯(lián)網(wǎng)絡含有遺傳性相同的細胞核,被稱為集落或菌絲體.與酵母污染相似,培養(yǎng)物的pH值在污染的初期保持穩(wěn)定,然后隨著培養(yǎng)物感染程度加劇而迅速增加,并變得渾濁.在顯微鏡下,菌絲體通常呈細長的絲狀體,有時呈密集的孢子團.許多種霉菌的孢子在休眠階段能夠耐受極其惡劣和不宜生長的環(huán)境,當其遇到合適的生長條件時才會被激活.

病毒是一種微小的感染性病原體,利用宿主細胞的結構進行繁殖.它們的體積極小,難以在培養(yǎng)中被檢測到,也難以從細胞培養(yǎng)實驗室使用的試劑中去除.由于大多數(shù)病毒對宿主有非常嚴格的要求,因此,它們通常不會對宿主以外物種的細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生不良影響.但被病毒感染的細胞培養(yǎng)物會對實驗室人員造成嚴重的健康威脅,尤其是當實驗室培養(yǎng)的是人類或靈長類的細胞時.要檢測細胞培養(yǎng)物是否被病毒感染,可以使用電子顯微鏡觀察 用抗體組合進行免疫染色 ELISA檢測或是使用合適的病毒引物進行PCR擴增.

雖然不如微生物污染普遍,但許多細胞系與HeLa以及其他快速生長細胞系之間的廣泛交叉污染已經(jīng)是一個明確的問題,會產(chǎn)生嚴重的后果.從值得信賴的細胞庫中獲取細胞系,定期檢查細胞系的特性,并使用良好的無菌技術進行操作,這些做法都將幫助您避免交叉污染.DNA指紋圖譜分析 核型分析和細胞亞型分析可以確定細胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染.

請勿在常規(guī)細胞培養(yǎng)中使用抗生素,因為抗生素的連續(xù)使用會促進耐藥菌株的生長,并導致輕度污染持續(xù)存在.一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除,就會發(fā)展成大規(guī)模污染.抗生素的持續(xù)使用還可能掩蓋支原體感染和其他隱性污染.此外,某些抗生素可能會與細胞發(fā)生交叉反應,干擾正在研究的細胞過程.抗生素只能作為對付污染的最后手段且只能短期使用,并應盡快從培養(yǎng)物中去除.如果長期使用抗生素,則應同時進行無抗生素培養(yǎng),作為檢測隱性感染的對照.

細胞培養(yǎng)的成功在很大程度上取決于保護細胞免受細菌 真菌和病毒等微生物的污染.非無菌用品 培養(yǎng)基和試劑 帶有微生物的空氣懸浮微粒 不干凈的培養(yǎng)箱以及工作臺面都是生物污染的來源.