萊克多巴胺檢測試劑盒使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣 組織 飼料等樣本中的萊克多巴胺（Ractopamine,RAC）,試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板 辣根酶標(biāo)記物 抗體 標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成.檢測時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液,樣本中的萊克多巴胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗萊克多巴胺抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含萊克多巴胺含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中萊克多巴胺的殘留量.

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb（ng/ml）

2.2 反應(yīng)模式：25℃,30min～15min

2.3 檢測下限：

尿液……………………………0.3ppb

組織……………………………0.4ppb

飼料 豬肝……………………2ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

萊克多巴胺 …………………… 100%

多巴酚丁胺………………………< 1%

克倫特羅…………………………<0.1%

沙丁胺醇…………………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

尿樣……………………………95%±10%

組織……………………………90%±15%

飼料 豬肝……………………80%±20%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb 0.1ppb 0.3ppb 0.9ppb 2.7ppb 8.1ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb…………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10×復(fù)溶液（黃蓋）……………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀 打印機(jī) 均質(zhì)器 氮?dú)獯蹈裳b置 振蕩器 離心機(jī) 刻度移液管 天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl,100µl-1000µl 多道300µl

4.3 試劑：甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

將10×復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋（1份10×復(fù)溶液加9份去離子水）,用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月.

配液2：工作洗滌液

將20×濃縮洗滌液20倍稀釋（1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水）.

配液3：樣本提取液

70%甲醇,即V甲醇:V去離子水=7：3.

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿樣處理方法：

    取1ml清亮尿樣（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min以得到清亮尿樣）于10ml離心管中,加入2ml復(fù)溶液（配液1）,混合振蕩30s,取50µl進(jìn)行分析.暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存.

樣本稀釋倍數(shù)：3    檢測下限：0.3ppb

5.3.2 組織樣本處理方法：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本1g±0.05g,加入3ml復(fù)溶液（配液1）,充分振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min （若組織樣本中油脂含量較高,可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心）.取50µl上清液進(jìn)行分析.

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 飼料 豬肝樣本前處理方法

1）稱取粉碎后的樣本1g±0.05g于15ml離心管中,加入4ml樣本提取液（配液3）,振蕩混勻2min,室溫4000r/min以上離心10min；

2）取上清液0.1ml于1.5ml離心管中,再加入0.4ml復(fù)溶液（配液1）,振蕩混勻30s,取50ul分析.

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：2ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻.取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃.

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置.

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)30分鐘.

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干（用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）.

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間）.

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng).

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）.測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成.

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值,再乘以100%,即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖.將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度.

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確 快速分析.（歡迎來電索�。�

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低.

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象.所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作.

8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性.

8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射.

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑.

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之.0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí),表示試劑可能變質(zhì).

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚.

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍.

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒.