發(fā)布時間：2024/7/1 9:44:15 閱讀次數(shù)：343
人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細胞吉西他濱耐藥株（ASPC-1/GEM）
細胞介紹
一個胰腺癌病人的腹水中的細胞移植到裸鼠后建立了這個細胞株.
細胞特性
1） 來源：ASPC-1耐藥篩選
2） 形態(tài)：上皮細胞樣,貼壁生長
3） 含量：>1×106 細胞數(shù)
4） 用途：僅供科研使用
細胞運輸 保存及注意事項
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| 復蘇細胞 | 凍存細胞 |
| 包裝 | 充液的T25細胞培養(yǎng)瓶 | 1mL凍存管 |
| 運輸條件 | 常溫 | 干冰 |
| 保存方式 | 75%酒精消毒瓶壁,置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱 | -80℃冰箱中保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮/立即復蘇 |
| 注意事項 | 1. 收到細胞請先就培養(yǎng)瓶/凍存管的外觀 細胞的狀態(tài),進行拍照并保存,如有問題請及時聯(lián)系我們； 2. 收到的復蘇細胞,若有較多細胞飄起,可能由于運輸導致.請先置于37℃細胞培養(yǎng)箱中靜置2~4h,待細胞貼壁后再做處理； 3. 復蘇細胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基,收到細胞后請及時更換為完全培養(yǎng)基； 4. 建議收到細胞后,首先進行擴增,并凍存部分細胞以備用. | |
細胞耐藥誘導過程
待細胞生長穩(wěn)定后,開始倍增藥物誘導劑量,每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上.遞增藥物濃度依次為：0.03μg/mL 0.3μg/mL 1.5μg/mL 3μg/mL 6μg/mL 12μg/mL 18μg/mL.約10個月后,細胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長,視為耐藥細胞株構(gòu)建成功,并命名為ASPC-1/GEM.
細胞培養(yǎng)試劑的配制
1）GEM藥物的配制及保存
建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物,使其完全溶解.
注意：可根據(jù)用量配置藥物,并將藥物分裝保存,避免反復凍融導致藥物失效.溶解后的GEM,4℃保存1周,-20℃保存1個月,-80℃保存6個月.
2）凍存液的配制
90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配.
3）完全培養(yǎng)基的配制（推薦使用h005-001b）
| 成分 | 體積/濃度 |
| 優(yōu)質(zhì)胎牛血清 | 10% |
| 雙抗 | 1% |
| GlutaMAX-1谷氨酰胺 | 1% |
| GEM | 0~18μg/mL |
| DMEM培養(yǎng)基 | 補充至所需體積 |
細胞培養(yǎng)條件
氣相：空氣,95%；二氧化碳,5%；溫度：37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%~80%.
細胞處理
1）凍存細胞的復蘇
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,1000rpm/min離心3~5min,棄去上清液.加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細胞后,均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中,置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況,2~3day換液.
注意：①細胞復蘇過程中,不可使用含有藥物的培養(yǎng)基.須在細胞完全貼壁,形態(tài)完全展開,生長狀態(tài)穩(wěn)定后,方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物.若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢,可適當降低GEM的濃度,或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時,再更換為所需的GEM濃度；
②建議復蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩,避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸,造成人員傷害.
2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）
①待細胞密度達到80%~90%時,即可進行傳代培養(yǎng).
②棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細胞1次,吸凈殘余的PBS.
③加入適當體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL,其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可）,置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min,顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落,即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落.迅速拿回操作臺,加入2倍體積的 含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化.
④將細胞懸液移入離心管中,1000rpm/min離心5min,棄去上清液.
⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞,輕吹混勻.將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中,添加6~8mL完全培養(yǎng)基,置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況,2~3day換液.
注意：細胞傳代過程中,不可使用含有藥物的培養(yǎng)基.須在細胞完全貼壁,形態(tài)完全展開,生長狀態(tài)穩(wěn)定后,方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物.若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢,可適當降低GEM的濃度,或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時,再更換為所需的GEM濃度.
3）細胞凍存
①細胞凍存時,步驟同2）細胞傳代的①~④,細胞計數(shù)后,加入配制好的細胞凍存液,重懸細胞,按照1×106 ~ 1×107個細胞/mL分配到一個凍存管中,標注好名稱 代數(shù) 日期等信息.
②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中,-80℃冰箱中過夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存.同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用.
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