無(wú)論新人還是老手,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中都可能遇到細(xì)胞污染的情況.那對(duì)于細(xì)胞污染,最重要的是預(yù)防,因?yàn)榧?xì)胞一旦污染,想救是非常困難的,即便救活,細(xì)胞狀態(tài)也會(huì)變差,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所以先來(lái)講講如何預(yù)防
 

　　無(wú)論新人還是老手,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中都可能遇到細(xì)胞污染的情況.那對(duì)于人源細(xì)胞或鼠源細(xì)胞的污染,最重要的是預(yù)防,因?yàn)榧?xì)胞一旦污染,想救是非常困難的,即便救活,細(xì)胞狀態(tài)也會(huì)變差,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所以先來(lái)講講如何預(yù)防.生物安全柜是細(xì)胞處理的主要場(chǎng)所,而培養(yǎng)箱是細(xì)胞生長(zhǎng)的主要場(chǎng)所,所以細(xì)胞污染通常就發(fā)生在這兩個(gè)地方.那么在使用生物安全柜和培養(yǎng)箱時(shí)如何做好預(yù)防措施呢？
首先,所有進(jìn)入安全柜的東西都要盡可能保證無(wú)菌.如果實(shí)驗(yàn)室條件允許,那直接購(gòu)買商品化的試劑和耗材是最穩(wěn)妥的,例如Gibco Hyclone的試劑,Eppendorf Corning的耗材,這些大品牌的試劑和耗材一般只要是正品都可以保證無(wú)菌.如果試劑需要自己用干粉配制,那么在配制中需要嚴(yán)格按無(wú)菌操作進(jìn)行.另外每次試劑配制量不宜過(guò)多,比如完全培養(yǎng)基建議以一到兩周內(nèi)用完為宜.試劑在分裝時(shí)可以考慮再用針頭式過(guò)濾器過(guò)濾一次,減少污染的可能性.如果所用移液器吸頭是散裝的,則注意在將吸頭裝入吸頭盒時(shí)需要帶手套,因?yàn)闇缇鷷r(shí)無(wú)法完全去除吸頭上可能粘附的油脂和其他雜質(zhì).
其次,安全柜每次使用前需要紫外照射30min滅菌,然后通風(fēng)5min以上保證換氣到位.每次處理細(xì)胞前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)需要的各種試劑 耗材備齊,盡量減少細(xì)胞處理過(guò)程中的來(lái)回走動(dòng).安全柜內(nèi)的東西盡量擺放有序,具體可以根據(jù)個(gè)人使用習(xí)慣而定,如果你使用的是公用安全柜,則可能需要使用前臨時(shí)調(diào)整.以個(gè)人為例,移液器和吸頭盒放右手邊,實(shí)驗(yàn)中常用試劑放右前方,廢液缸放左前方,并保證和試劑有一定安全距離,右角放置培養(yǎng)皿,左角放置其他耗材.大致原則是盡量保證最常用的東西靠右,次常用的東西靠左,右邊操作區(qū)域?yàn)闈崈魠^(qū),左邊操作區(qū)域?yàn)榉菨崈魠^(qū),左撇則相反.
然后,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有試劑不用時(shí)需要蓋上瓶蓋,瓶蓋打開時(shí)除了干凈的吸頭,其他任何東西都不要從瓶口的上方經(jīng)過(guò).如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,則處理時(shí)不要長(zhǎng)時(shí)間打開皿蓋.如果所用吸頭沒(méi)有濾芯,那在使用時(shí)注意不要將試劑倒吸入移液器,如果倒吸的是培養(yǎng)基,極易成為細(xì)菌生長(zhǎng)的溫床.一把有菌的移液器可以輕松污染所有使用其處理過(guò)的細(xì)胞,所以一旦發(fā)生倒吸,要及時(shí)用酒精棉球擦去倒吸的試劑,有條件的建議使用帶濾芯的吸頭.由于使用安全柜的過(guò)程中手和前臂都要進(jìn)入安全柜,所以有條件的可以準(zhǔn)備一件細(xì)胞房專用無(wú)塵服,使用前裝入布袋消毒后烘干,在細(xì)胞房中取出,非更換前不要穿出細(xì)胞房.沒(méi)有條件的則可以準(zhǔn)備一副袖套,每次用完后放安全柜中紫外消毒.無(wú)論是否穿戴無(wú)塵服或者袖套,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只要手出了安全柜,再進(jìn)入前都需要用75%的酒精消毒.
最后,如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱前搖勻時(shí)要輕柔,不要將培養(yǎng)基搖到皿蓋和皿身的間隙中,這樣在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)很容易污染.如果使用瓶蓋沒(méi)有氣孔的細(xì)胞瓶培養(yǎng)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱前需要將瓶蓋擰松半圈左右,保證瓶?jī)?nèi)外可以進(jìn)行氣體交換,注意不要擰太松,這樣在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)也很容易污染,有條件的建議選擇瓶蓋有氣孔的細(xì)胞瓶,這樣放入培養(yǎng)箱前直接擰緊瓶蓋即可.由于培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和濕度很高,所以最好定期用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱消毒.培養(yǎng)箱里水槽中的水需要使用無(wú)菌水,不可以用自來(lái)水.

那么細(xì)胞如果還是不幸污染了又該怎么辦呢？把細(xì)胞污染分為早期污染和晚期污染兩種情況.早期污染是細(xì)胞狀態(tài)變差,但依舊能保持生長(zhǎng),顯微鏡下未見(jiàn)明顯微生物或可見(jiàn)少量微生物.這種情況的話我們?cè)趽Q液時(shí)可以多用PBS洗幾次,然后加入適合的抗生素.早期污染只要發(fā)現(xiàn)及時(shí),處理得當(dāng),救回來(lái)的可能性還是很大的.晚期污染則是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞停止生長(zhǎng),顯微鏡下可見(jiàn)大量微生物.這時(shí)候建議大家及時(shí)清理掉相關(guān)細(xì)胞,以免污染其他細(xì)胞.在對(duì)安全柜和培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒后,再重新復(fù)蘇早批次的細(xì)胞.細(xì)心的會(huì)發(fā)現(xiàn),新細(xì)胞收到后,不應(yīng)急于開展實(shí)驗(yàn),而應(yīng)該先小心培養(yǎng),凍存一到兩個(gè)批次的細(xì)胞后再開展實(shí)驗(yàn),這樣實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如果細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題,可以有凍存細(xì)胞保證實(shí)驗(yàn)還能繼續(xù)進(jìn)行.