免疫熒光染色分為直接法和間接法.直接法是熒光素直接標(biāo)記在一抗上,孵育后直接觀測,快速高效,還可以與多個標(biāo)記抗體一起做多重?zé)晒馊旧?間接法是熒光素標(biāo)記在二抗上,相比直接法染色背景更干凈,費用花費也少.
免疫熒光染色與免疫組化前期處理相同,因為內(nèi)源性過氧化物酶對免疫熒光實驗沒有影響,同時雙氧水反而會干擾到熒光素發(fā)光,所以這步操作在免疫熒光中不需要做.
常用的熒光顯微鏡一般有三個通路,激發(fā)波長為350nm 488nm 555nm附近,分別對應(yīng)的熒光發(fā)射光顏色為藍(lán)光 綠光 紅光.
350nm常用熒光素：DAPI（復(fù)染用）,Alexa Fluor 350
488nm常用熒光素：FITC,Alexa Fluor 488
555nm常用熒光素：PE Cy3 Rhodamine B Alexa Fluor555
另有其他常見熒光素
594nm常用熒光素：Texas Red Alexa Fluor594
647nm常用熒光素：Cy5 APC Alexa Fluor647
免疫熒光雙重染色熒光雙染或多重染色是指將帶有不同熒光素標(biāo)記的抗體孵育在同一張切片上,鏡下觀察時將不同的顏色組合在一起,將不同的抗原表達(dá)情況一起呈現(xiàn)出來,這樣分析多個抗原的關(guān)聯(lián)性更客觀 更直接.
熒光雙染也有直接法和間接法.直接法是使用帶有不同熒光素標(biāo)記的兩個抗體同時孵育后觀測；間接法需要用到兩個不同種屬來源的一抗（例如一個鼠源抗體,一個兔源抗體）,后面要選擇與一抗相對應(yīng)的二抗同時需要帶有不同的熒光素標(biāo)記（例如FITC標(biāo)記山羊抗小鼠和Cy3標(biāo)記山羊抗兔）,間接法需要同時兼顧一抗和二抗的種屬關(guān)系,避免出現(xiàn)相互的交叉反應(yīng).
石蠟切片的免疫熒光單染（間接法）
1.石蠟切片正常脫蠟至水,PBS洗5分鐘,2次
2.抗原修復(fù),0.01M枸櫞酸修復(fù)液,沸水浴熱修復(fù)15分鐘
3.正常山羊血清封閉20分鐘,37℃
4.一抗孵育,4℃過夜.
5.PBS洗5分鐘,3次
6.熒光標(biāo)記二抗孵育,37℃,90分鐘
7.PBS洗5分鐘,3次
8.DAPI復(fù)染,PBS洗5分鐘,3次
9.防淬滅熒光封片劑封片
10.鏡檢
