人多能干細胞培養(yǎng)液,即 Human Pluripotent Stem Cell Medium,也稱人胚胎干細胞培養(yǎng)液( Human Embryonic Stem Cell Medium),是一種配方獨特 化學(xué)成分明確 專用于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系下的人類誘導(dǎo)多能干細胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)或人類胚胎干細胞(Human embryonic stem cell)的無血清培養(yǎng)液.
本產(chǎn)品可避免使用成分不明確的動物細胞外基質(zhì)提取物Matrigel Geltrex或的Matrix-Gel™基質(zhì)膠(C0371/C0372/C0376/C0383/C0387/C0392/C0396).
本產(chǎn)品和Human Vitronectin (C0318/C0319)聯(lián)合使用有非常好的培養(yǎng)效果,可大幅降低培養(yǎng)成本.
圖1.在使用Human Vitronectin包被的條件下,人多能干細胞培養(yǎng)液對于人胚胎干細胞和人誘導(dǎo)多能干細胞的培養(yǎng)效果圖.本產(chǎn)品培養(yǎng)的hES和hiPSCs均能在Day2形成邊緣清晰 銳利的克隆,在Day3克隆直徑增大到1mm左右,呈現(xiàn)內(nèi)部細胞排列緊實(Compact) 表面平滑的胚胎干細胞克隆或誘導(dǎo)多能干細胞克隆形態(tài).Day3后細胞增殖的減緩,同時會伴隨正常的小部分細胞凋亡.上述形態(tài)學(xué)特征和增殖速率的動態(tài)變化與文獻描述基本一致[3].根據(jù)圖中檢測結(jié)果,與國外知名品牌Competitor G的同類產(chǎn)品相比,本產(chǎn)品實測對上述三種人胚胎干細胞或人誘導(dǎo)多能干細胞的培養(yǎng)效果均顯著優(yōu)于國外同類品牌產(chǎn)品.實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件等的不同而存在差異,本圖僅供參考.
本產(chǎn)品在使用基質(zhì)膠,例如基質(zhì)膠的情況下,同樣能取得非常理想的培養(yǎng)效果.本產(chǎn)品在使用時培養(yǎng)的人胚胎干細胞和人誘導(dǎo)多能干細胞的克隆形態(tài)如圖2所示.
圖2.在基質(zhì)膠包被條件下,人多能干細胞培養(yǎng)液(對于人胚胎干細胞和人誘導(dǎo)多能干細胞的培養(yǎng)效果圖.如圖所示,本產(chǎn)品培養(yǎng)的hES和hiPSCs均能在Day2形成邊緣清晰 銳利的克隆,在Day3克隆直徑增大到1mm左右,呈現(xiàn)內(nèi)部細胞排列緊實(Compact) 表面平滑的胚胎干細胞克隆或誘導(dǎo)多能干細胞克隆形態(tài).Day3后細胞增殖的減緩,同時會伴隨正常的小部分細胞凋亡.上述形態(tài)學(xué)特征和增殖速率的動態(tài)變化與文獻描述基本一致[3].根據(jù)圖中檢測結(jié)果,與國外知名品牌Competitor G和國內(nèi)某品牌Competitor S同類產(chǎn)品相比,本產(chǎn)品實測對上述人胚胎干細胞或人誘導(dǎo)多能干細胞的培養(yǎng)效果相近或更優(yōu).實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件等的不同而存在差異,本圖僅供參考.
人胚胎干細胞(hES H9）在使用 Human Vitronectin包被的情況下,在短期培養(yǎng)(連續(xù)傳代20次以內(nèi))時對多能干細胞未分化狀態(tài)的維持效果如圖3所示.圖中可見,在該培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)5代時多能干細胞蛋白標(biāo)志物SOX2 TRA-1-81和OCT4免疫熒光檢測和堿性磷酸酶染色都呈現(xiàn)強陽性；而干細胞分化標(biāo)志物SSEA1免疫熒光檢測陰性.連續(xù)傳代到10和20次后,干細胞未分化特征性基因OCT4在P5,P10和P20不同代次中均穩(wěn)定維持較高的水平.同樣,反應(yīng)干細胞已經(jīng)分化的特征性基因SOX17,hT(Brachyury)和SOX1的mRNA水平維持極低水平,且在這些代次間無顯著差異,提示細胞處于未分化狀態(tài).
圖3.使用人多能干細胞培養(yǎng)液(C0800)并使用的 Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情況下能很好維持人胚胎干細胞(hES H9)的未分化狀態(tài).圖A,使用多能干細胞免疫熒光檢測試劑盒(C3266, C3279, C32613, C3272)分別檢測連續(xù)傳代五次后的多能干細胞,結(jié)果顯示干細胞多能性蛋白標(biāo)志物SOX2 TRA-1-81和OCT4呈現(xiàn)正常的強陽性,而分化標(biāo)志物SSEA1則未檢測到表達.圖B,使用多能干細胞堿性磷酸酶顯色試劑盒(C3250)檢測顯示高水平的堿性磷酸酶活性,提示為未分化狀態(tài).圖C,qRT-PCR分析顯示多能干細胞未分化特征基因OCT4,以及內(nèi)胚層(SOX17) 中胚層(hT(Brachyury))和外胚層(SOX1)分化基因在不同培養(yǎng)代次之間的無顯著差異.mRNA水平的上述檢測結(jié)果提示本產(chǎn)品可穩(wěn)定維持多能干細胞的未分化狀態(tài).實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件 檢測儀器等的不同而存在差異,圖中效果僅供參考.
人胚胎干細胞(hES H9）在使用 Human Vitronectin包被的情況下,至少培養(yǎng)5代后仍具有多能干細胞的三胚層分化潛能(圖4).
圖4.使用人多能干細胞培養(yǎng)液(C0800)并使用 Human Vitronectin 包被的情況下,培養(yǎng)5代后的人胚胎干細胞(hES H9)仍具有三胚層分化潛能.圖A, H9克隆制備為單細胞后(0 day post differentiation, 0dpd),自發(fā)分化形成擬胚體(3dpd和5dpd),并在6dpd接種到BeyoEmbryo™ 0.1%明膠溶液(C0316)包被下培養(yǎng)24小時(7dpd)后形態(tài)學(xué)特征.圖B,RT-PCR結(jié)合電泳檢測7dpd時早期分化基因的表達變化.內(nèi)胚層(hSOX17和AFP) 中胚層(hT(Brachyury)和BMP4) 外胚層(OTX1和SOX1)均能在7dpd時顯著增加.圖B中PCR擴增片段為：SOX17 (199bp)；AFP (215bp)；BMP4 (112bp)；hT(Brachyury) (121bp)；SOX1 (425bp)；OTX1 (121bp).*,非特異擴增條帶(大小不符).實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件等的不同而存在差異,圖中效果僅供參考.
人胚胎干細胞(hES H9）在使用 Human Vitronectin 包被的情況下,連續(xù)培養(yǎng)人胚胎干細胞50代后仍能保持未分化狀態(tài)和遺傳穩(wěn)定性(圖5).
圖5.使用人多能干細胞培養(yǎng)液并使用 Human Vitronectin 包被的情況下,人胚胎干細胞H9細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代50次后仍能保持未分化狀態(tài)并具有遺傳穩(wěn)定性.圖A,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)多能干細胞標(biāo)志物Tra-1-60 SOX2和OCT4高水平表達,表明細胞處于未分化狀態(tài).圖B, 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi) 中 外胚層早期分化標(biāo)志物AFP hT(Brachyury)和Nestin均為陰性,表明細胞處于未分化狀態(tài).圖中綠色代表相應(yīng)蛋白標(biāo)志物的免疫熒光染色,藍色為DAPI染色.圖C, 傳代50次后的H9克隆核型分析(Karyotype analysis)顯示長期傳代后的遺傳穩(wěn)定性(染色體數(shù)量).實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件等的不同而存在差異,圖中效果僅供參考.
人胚胎干細胞(hES H9）在使用 Human Vitronectin 包被的情況下,連續(xù)培養(yǎng)人胚胎干細胞50代后的多能干細胞三胚層分化潛能檢測如圖6所示.
圖6.使用人多能干細胞培養(yǎng)液連續(xù)傳代H9細胞50次后仍具有三胚層分化潛能.圖A,H9克隆制備為單細胞后(0dpd),自發(fā)分化下形成擬胚體(3dpd和5dpd),并在6dpd接種到BeyoEmbryo™ 0.1%明膠溶液(C0316)包被下培養(yǎng)24小時(7dpd)后形態(tài)學(xué)特征.圖B,qRT-PCR定量分析對比0dpd (未分化)和自發(fā)分化7天(7dpd)后,多能性(Pluripotency)標(biāo)志基因NANOGmRNA水平大幅下降,而三胚層分化標(biāo)志物SOX17 (內(nèi)胚層) hT(Brachyury) (中胚層)和Nestin (外胚層)均明顯上調(diào),提示在連續(xù)傳代50次的長期培養(yǎng)下,本產(chǎn)品仍然能維持多能干細胞的三胚層分化潛能.實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件等的不同而存在差異,圖中效果僅供參考.
