發(fā)布時間：2024/11/7 9:01:37 閱讀次數(shù)：141
產(chǎn)品及特點
單純皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒可用于檢測單純皰疹病毒 1 型.單純皰疹是一種由單純皰疹病毒所致的病 毒性皮膚病,中醫(yī)稱為熱瘡.能引起人類多種疾病,如齦口炎 角膜結(jié)膜炎 腦炎以及 生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染.在感染宿主后,常在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染,激活后 又會出現(xiàn)無癥狀的排毒,在人群中維持傳播鏈,周而復(fù)始的循環(huán).單純皰疹病毒 1 型是 單純皰疹病毒的一類,可通過呼吸道 皮膚接觸等傳染,并且是口腔疾病的主要病原體. 本產(chǎn)品是根據(jù)染料法熒光定量 PCR 原理開發(fā)的單純皰疹病毒 1 型檢測試劑盒,它具有下 列特點：
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板.
2. 引物等組分經(jīng)過優(yōu)化,靈敏度高.
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品.
4. 特異性高,引物是根據(jù)單純皰疹病毒 1 型 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他微 生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng).
5. 既可用于定性檢測,又可用于定量檢測.用于定量檢測時線性范圍至少為5 個數(shù) 量級.
6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的染料法熒光定量 PCR 反應(yīng).
7. 本產(chǎn)品只能用于科研.
成分規(guī)格
| 產(chǎn)品組成 | 編號 | 規(guī)格 |
| 2 ×SYBR qPCR Mix | GZ020801 | 550 μL |
| DEPC-H2O | GZ070401 | 1 mL |
| 熒光模板稀釋液 | GZ070407 | 1 mL |
| 單純皰疹病毒 1 型染料法 qPCR 引物 混合液 |
GZ1464110yw |
260 μL |
| 單純皰疹病毒 1 型染料法 qPCR 陽性 對照(1×10E8 拷貝/μL) |
GZ1464110pc |
50 μL |
保存條件
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為一年.陽性對照需要單獨放置,不要污染其他試 劑.
使用方法
一 DNA 提取(樣本制備區(qū))
1. （選做）如果有 N 個樣品待提取,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的是 PC（樣品制 備陽性對照）和 NC（樣品制備陰性對照）.可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液 10μL 再加 上一定量的水,使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致,以此作為 PC .另外用水作為 NC.
2. 用自選方法提取純化樣品 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容. 建議使用病毒基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA.
二 稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽性對照濃度高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,避免污染樣 品或本試劑盒的其他成分）.
1. 標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7 ,6 ,5 ,4 ,3 ,2.
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液,（最好用帶芯槍頭,下同）.
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供) ,充分震蕩 1 分鐘, 得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品.放冰上待用.
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得) ,充分震 蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品.放冰上待用.
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得) ,充分震 蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品.放冰上待用.
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品.放冰上待用. 若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可.
三 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
向各 qPCR 管中分別加入下列成分.
| 成分 | N 個 待檢樣品管 | qPCR 陰性對照 | qPCR 陽性對照 |
| 2 ×SYBR qPCR Mix | 各 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| 50× ROX Reference Dye I or II （用戶自備） | 各 0.4 μL | 0.4 μL | 0.4 μL |
| 單純皰疹病毒 1 型染料法 qPCR 引物 混合液 | 各 4.6μL | 4.6μL | 4.6μL |
注：需使用 ROX Reference Dye I 的機型：ABI Prism5700 7000 7300 7700 7900 7900HT 7900HT Fast Step-One Step-One Plus.
需使用 ROX Reference Dye II 的機型：ABI Prism 7500/7500Fast ViiA7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P.
不需要使用ROX 的機型：Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche
Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler .（用 DEPC- H2O 補足即可）
轉(zhuǎn)移至模板添加區(qū).
四 添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 5 μL 模板,加樣順序為陰性對照（DEPC-H2O） 待測樣品模 板 單純皰疹病毒 1 型 qPCR 陽性對照,離心 30 秒,立即進行擴增反應(yīng).
五 擴增反應(yīng)(擴增及產(chǎn)物分析區(qū))
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應(yīng)位置,進行擴增,擴增程序如下：
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 3 min |
| qPCR 反應(yīng) （45 個循環(huán)） | 95℃ | 30 sec |
| 60℃ | 30 sec（SYBR 通道采集熒光信號） | |
| 按儀器預(yù)設(shè)程序進行熔解曲線分析 | ||
六 結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線.再以待測樣品的 Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,推算出其濃 度.
2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照（1×10E5 拷貝/μL）結(jié)果：Ct 值<30,有明顯指數(shù)增長,呈典型的 S 型曲線. 陰性對照結(jié)果：Ct 值>40 或無 Ct值,無明顯指數(shù)增長期和平臺期.
樣本檢測結(jié)果：Ct 值<38 ,有明顯指數(shù)增長,表明樣本中檢測出單純皰疹病毒 1 型, 結(jié)果為陽性；Ct 值>40 或無 Ct值,表明樣本中未檢測出單純皰疹病毒 1 型,結(jié)果為陰性； Ct 值在 38-40 范圍,應(yīng)對樣本進行復(fù)檢,如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct值仍在 38-40 范圍,熔解曲 線的峰值與陽性對照相同,則該樣本判斷為陽性；若不相同,熔解 Tm值與目的擴增片段 Tm 值相差≥2℃ , 則為非特異性擴增,該樣本判斷為陰性.
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