【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：布魯氏菌檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Brucella Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 50T/盒
【預(yù)期用途】
布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的畜源性人畜共患傳染病，在牛、羊、豬中常發(fā)生，患病家畜是人類布魯氏菌病的主要傳染源。近年來全國各地布魯氏菌病疫情有上升的趨勢，給畜牧業(yè)發(fā)展及人類身體健康帶來極大的危害和威脅，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，主要用于布魯氏菌的定性篩查檢測。
【檢驗原理】
本試劑盒針對布魯氏菌基因設(shè)計特異性引物和分子信標(biāo)探針，在待檢樣本中含有布魯氏菌DNA的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 50T/盒 |
| 1 | 布魯氏菌 PCR反應(yīng)液 | 875 μL×1管 |
| 2 | 布魯氏菌 混合酶液 | 125 μL×1管 |
| 3 | 布魯氏菌 陰性對照 | 40 μL×1管 |
| 4 | 布魯氏菌 陽性對照 | 40 μL×1管 |
| 5 | 說明書 | 1份 |
注：陰性對照為不含布魯氏菌的其它菌的混合物，陽性對照為滅活的布魯氏菌。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 如使用原始標(biāo)本進(jìn)行檢測。標(biāo)本（病人腦脊液、靜脈血、關(guān)節(jié)液；病畜靜脈血，乳汁；菌落，菌苔等）應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標(biāo)本。
2. 如需在增菌后進(jìn)行PCR檢測，則應(yīng)使用選擇性增菌液對原始標(biāo)本進(jìn)行增菌。
3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。
【檢驗方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
| 單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
| 混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4) 蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操.
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
| 反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集布魯氏菌熒光信號 |
| PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
| 55℃：40秒（s） | |||
| PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
| 55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
| 通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
| FAM | |
| 陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出布魯氏菌 |
| 陽性（＋） | 標(biāo)本中檢測出布魯氏菌 |
【檢驗方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
2. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
3. 為保證試劑不受標(biāo)本污染，必須將混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。
