細(xì)胞介紹

LOVO/5-FU為由LOVO細(xì)胞構(gòu)建的耐5-FU藥物細(xì)胞株。

細(xì)胞特性

1）來源：人結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥篩選	2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長
3）含量：>1×106 細(xì)胞數(shù)	4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5）用途：僅供科研使用。

細(xì)胞運(yùn)輸、保存及注意事項(xiàng)

	復(fù)蘇細(xì)胞	凍存細(xì)胞
包裝	充液的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶	1mL凍存管
運(yùn)輸條件	常溫	干冰
保存方式	37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱	-80℃冰箱中保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮 或立即復(fù)蘇
※注意事項(xiàng)	1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、漏液及細(xì)胞有污染；或凍存管有破損，融化、漏液等，請立即拍照并聯(lián)系我們。照片包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶/凍存管外觀，顯微鏡下細(xì)胞照片（100倍，200倍各2張）； 2. 若收到的復(fù)蘇細(xì)胞有少量細(xì)胞脫落、飄起，可能由于運(yùn)輸途中導(dǎo)致。請先于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2~3h后，再進(jìn)行處理； 3. 復(fù)蘇細(xì)胞的充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，血清濃度較低，收到細(xì)胞后請及時(shí)更換為完全培養(yǎng)基； 4. 建議收到細(xì)胞后，首先進(jìn)行擴(kuò)增（至少3代），并凍存部分細(xì)胞以備用。 5. 初次培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)約80%時(shí)，可加入含5-FU的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合后傳代。若細(xì)胞傳代過程中細(xì)胞停止增殖，且狀態(tài)較差，則需降低藥物濃度（首次降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，且生長狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的5-FU藥物濃度。 6. 細(xì)胞凍存過程中，不可添加藥物，且凍存液中不含藥物。

細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1）5-FU藥物的配制及保存

建議將5-FU藥物配制成160mM的母液。

注意：可根據(jù)用量配制藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。（凍存液中不含藥物）

3）完全培養(yǎng)基的配制

成分	體積/濃度
優(yōu)質(zhì)胎牛血清	10%
雙抗	1%
160uM 5-FU	0.1%（160mM母液）
F12K培養(yǎng)基	補(bǔ)充至所需體積

細(xì)胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

注意：①細(xì)胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%左右時(shí)，方可添加5-FU藥物；若細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低5-FU的濃度（首次降低一半藥物濃度），或使用不含5-FU的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的5-FU濃度。

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩，避免凍存管處于溫差較大情況下發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶至細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺(tái)，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個(gè)新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基。

注意：若此過程中細(xì)胞停止增殖，且狀態(tài)較差，則需降低藥物濃度（首次降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合度約80%，且生長狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的5-FU藥物濃度。

3）細(xì)胞凍存

①細(xì)胞凍存時(shí)，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×106 ~ 1×107個(gè)細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

注意：細(xì)胞凍存過程中，不可添加藥物。

②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用