產(chǎn)品及特點

施馬倫貝格病毒（Schmallenberg Virus，SBV）是一種RNA病毒，是一種正本雅病毒屬的新病毒，感染癥狀為發(fā)熱、腹瀉、乏力等，感染此病毒的奶牛產(chǎn)奶量降低，以及新生幼畜出現(xiàn)缺陷等。目前還沒有發(fā)現(xiàn)它能感染人的證據(jù)，因此快速準確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，本產(chǎn)品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測施馬倫貝格病毒的試劑盒。

它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)施馬倫貝格病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒

RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分

編號

十孔盒包裝

探針法qRT-PCR緩沖液

190504a

500 μL（藍蓋）

探針法qRT-PCR酶混合液

190504b

100 μL（紅蓋）

熒光PCR 專用模板稀釋液

180701

1 mL（黃蓋）

施馬倫貝格病毒探針法qRT-PCR 引物混合液

15-90300yw

100 μL（白蓋）

施馬倫貝格病毒qRT-PCR 探針

15-90300pb

50 μL（棕色管）

施馬倫貝格病毒探針法qPCR陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)

60908-90300pc

50 μL（黃蓋）

使用手冊

15-90300sc

1 份

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑

樣品 RNA。

使用方法

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震

蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E6 拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用

5. 換槍頭，在 5 號管中加入5μL 1×10E6 拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）�？梢杂� 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA 提取試劑盒兼容。也可以向我公司購買柱式病毒RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）

成分

樣品管

N+2 個

PCR 陰性

對照管

標準曲線

樣品管（2-7 管）

探針法qRT-PCR緩沖液

各10μL

10μL

各10μL

探針法qRT-PCR酶混合液

各2μL

 2μL

各2μL

施馬倫貝格病毒 qPCR 探針

各1μL

1 μL

各1μL

施馬倫貝格病毒探針法 qPCR 引物混合液

各2μL

2 μL

各2μL

待測樣本 RNA 模板

5 μL

-

-

超純水

-

5 μL

-

第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液

（2-7 號）

-

-

 各5μL（2 號樣到

2 號管，3 號樣到 3 號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于35，則為陽性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

施馬倫貝格病毒可視化 LAMP 檢測試劑盒