【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測(cè)狂犬病病毒，對(duì)狂犬病病毒引起的疾病診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)狂犬病病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含狂犬病病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號(hào) | 組成 | 25 T/盒 | 50 T/盒 |
| 1 | PCR反應(yīng)液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
| 2 | 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
| 3 | 陽(yáng)性對(duì)照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 4 | 陰性對(duì)照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 5 | 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 |
注：陰性對(duì)照為犬基因組DNA，陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)滅活處理的狂犬病病毒核酸提取物。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.70日齡以?xún)?nèi)流產(chǎn)胎兒、死胎、木乃伊胎及弱仔的腦、腎、睪丸、腸系膜淋巴結(jié)或母犬的胎盤(pán)、陰道分泌物和精液均可作為檢測(cè)病毒的材料。以腸系膜淋巴結(jié)和肝臟檢出率最高。
2.血液或血清樣品：使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè)；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
| 單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
| 混合酶液 | 2.5 μL |
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司病毒提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
| 反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集狂犬病病毒熒光信號(hào) |
| PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| UNG酶 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
| 55℃：40秒（s） | |||
| PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
| 55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)或Ct值≤33。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤33或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在33～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在33～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
| 通道及檢測(cè)結(jié)果 | 標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋 |
| FAM | |
| 陽(yáng)性（＋） | 標(biāo)本中檢出狂犬病病毒DNA |
| 標(biāo)本中未檢出狂犬病病毒DNA |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項(xiàng)】
1. 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線(xiàn)殺菌裝置。
2. 為避免DNA降解，樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。
3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。
6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。
