| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌（Escherichia coli），屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。 | ||||
| 大腸桿菌 O157:H7 是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia | |||||
| coli, EHEC)的最常見類型，O 表示抗原類型, H7 表示血清型。其感染劑量極低， | |||||
| 人體只要攝入 10 個(gè)細(xì)菌就可以致病，目前還沒有特效疫苗，因此大量開展預(yù)防 | |||||
| 檢測(cè)工作具有重要的意義。目前對(duì) O157 的檢測(cè)主要是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學(xué) | |||||
| 和分子水平的 PCR 檢測(cè)。本試劑盒就是利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)開發(fā)的大 | |||||
| 腸桿菌 O157:H7 檢測(cè)試劑盒，它通過熒光染料實(shí)時(shí)顯示樣品模板 DNA 的量， | |||||
| 并通過坐標(biāo)曲線表示出來，結(jié)果直觀準(zhǔn)確。它具有下列特點(diǎn)： | |||||
| 1.即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。 | |||||
| 2.熒光定量 PCR 檢測(cè)，反應(yīng)特異性強(qiáng)。 | |||||
| 3.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 | |||||
| 規(guī)格及成分 |
| 成分 | 編號(hào) | 50 次塑料袋包裝 |
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| 2×qPCR Mix | 90408 | 1.0 mL | |||
| O157:H7 專一性引物對(duì) | yw13851386 | 200 μL | |||
| O157:H7 陽性對(duì)照， XXX 10E9 拷貝/μL |
yw13871388 |
100 μL | |||
| 超純水 | 100935 | 1 mL | |||
| 使用手冊(cè) | 1 份 | ||||
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。 | ||||
| 自備試劑 | 樣品等 | ||||
| 使用方法 | 一、樣品 DNA 的制備 | ||||
| 用自選方法提取細(xì)菌樣品 DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的 | |||||
| 關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢 | |||||
| 測(cè)靈敏度。 | |||||
| 二、制備 O157:H7 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo) | |||||
| 準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣 | |||||
| 品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品 | |||||
| 不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 DNA 片段 | |||||
| 作為陽性對(duì)照。 | |||||
| 1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號(hào)。 | |||||
| 2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（最好用帶芯槍頭，下同）。 | |||||
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| 3.先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到 | ||||
| 10E7 拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7 | |||||
| 拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。 | |||||
| 4.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 O157:H7 陽性對(duì)照(上步稀釋所 | |||||
| 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。 | |||||
| 5.換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 | |||||
| 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。 | |||||
| 6.換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6 | |||||
| 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。 | |||||
| 7.NC 管中不加任何陽性對(duì)照。 | |||||
| 8.從 1-6 號(hào)管中分別取 5 μL 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見下步），每個(gè) | |||||
| 樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值， | |||||
| 并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 | |||||
| 三、PCR 檢測(cè)（20 μL 體系） | |||||
| 1.在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次）： | |||||
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注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR | |||||
| 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 | |||||
| RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。 | |||||
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2.建議 PCR 反應(yīng)參數(shù)（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化） | |||||
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| 過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
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| 預(yù)變性 | 95℃ | 10 min | |||
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| PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 15 s |
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| 60℃ | 30 s | ||||
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3.數(shù)據(jù)采集 | |||||
| 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 | |||||
| DNA 時(shí)，最大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的最大吸收光譜在 500 nm， | |||||
| 最大發(fā)射光譜在 530 nm。 | |||||
| 四、數(shù)據(jù)處理 | |||||
| 以 O157:H7 陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 | |||||
| 線。再以待測(cè)樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測(cè)樣品的 Ct 值 | |||||
| 計(jì)算出樣品 DNA 的濃度。 | |||||
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | 鸚鵡熱衣原體熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒（CAT#:11-3780） | ||||
