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柱式病毒DNA提取試劑盒(柱式病毒DNAout)

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柱式病毒 DNAOUT是在一管式病毒 DNAOUT 的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的、專(zhuān)門(mén)用于從血清(血漿)等液體樣品及拭子(咽拭子、鼻拭子、口腔拭子、陰道拭子等)中提取微量病毒DNA 的產(chǎn)品,

它具有下列特點(diǎn):
1. 操作簡(jiǎn)單,整個(gè)過(guò)程只需要 20 分鐘左右,不需要額外在洗柱液中補(bǔ)加乙醇。
2. 靈敏度高,通過(guò) PCR 檢測(cè)到的最終靈敏度可以達(dá)到 30-50 拷貝/mL。
3. 安全無(wú)毒,不需要使用苯酚和氯仿等有機(jī)溶液。
4. 如果加上病毒離心富集步驟,最多可以處理 1.5 mL 液體病毒樣品。
5. 與 PCR 和熒光 PCR 兼容。
6. 價(jià)廉物美,性?xún)r(jià)比遠(yuǎn)高于國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品。
7. 適用于各種材料,包括血清、血漿、腦脊液、尿液、糞便、培養(yǎng)細(xì)胞上清液等無(wú)細(xì)胞材料。
1. 如果有 N 個(gè)樣品,標(biāo)記 N+2 個(gè) 1.5-2 mL 螺旋蓋塑料離心管(如 Sarstedt,多出的一個(gè)為陽(yáng)性對(duì)照,一個(gè)為陰性對(duì)照。為避免污染,建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個(gè)管上做個(gè)標(biāo)記,以在后續(xù)操作時(shí)區(qū)別向心面和離心面。然后在離心管中分別加入 0.2 mL 液體樣品(血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼淚等等),陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品,則將拭子放入 0.2mL 自備生理鹽水中擠壓出液體,然后取 0.2mL 進(jìn)行提取。
1.2、 如果是糞便等半固定樣品,則取約 0.3mL 的樣品,加入 0.3mL 自備生理鹽水,震蕩重懸,離心取 0.2mL 上清進(jìn)行提取。
1.3、 如果血液,細(xì)胞培養(yǎng)液等含細(xì)胞的液體,可以離心用上清,也可以直接取用,但后者提取的病毒 DNA 中會(huì)有少量細(xì)胞的基因組 DNA 污染(但不影響 PCR)。血漿的抗凝劑必須是 EDTA 或 ACD,不能是肝素。使用ACD 時(shí)由于所加入 ACD 會(huì)增加體積,樣品會(huì)被稀釋?zhuān)玫降牟《镜味葧?huì)比使用 EDTA 低 15%左右。血漿最好按 0.6mL/管的量分裝保存,以避免反復(fù)凍融。
1.4、 如果樣品是實(shí)體組織或培養(yǎng)細(xì)胞,則需要在自備生理鹽水中勻漿后離心,用 0.2mL 上清液(含病毒)進(jìn)行提取,但此種情況下最后得到的病毒DNA 不可避免的會(huì)含有少量基因組 DNA 污染(但不影響 PCR 檢測(cè))。
1.5、 如果液體樣品中的病毒需要富集,可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液體在 4℃ 24,000 g 冷凍離心 60 分鐘, 移棄 1.3 mL、用剩下的 0.2mL 繼續(xù)操作。
2. 加入 0.6 mL DNA 病毒裂解液到各離心管中,振蕩 30 秒混勻后室溫放置 10 分鐘裂解病毒。注意:DNA 病毒裂解液在 4℃放置后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀,使用前必須放在 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用。
3. 加入 0.8mL 上柱結(jié)合液到離心管中,顛倒混勻后轉(zhuǎn)移一半的混合液(0.8mL)到離心吸附柱中,室溫放置 2 分鐘。
4. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘,棄收集管中的穿透液,把離心吸附柱放回到收集管中。
5. 將剩余的另外一半裂解液(0.8mL)轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中,室溫放置 2 分鐘。
6. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘,棄收集管中的穿透液,把離心吸附柱放回到收集管中。
7. 加入 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中,12,000 rmp 室溫離心 1 分鐘,棄收集管中的穿透液,把離心吸附柱放回到收集管中。
8. 加入 0.3 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中,12,000 rmp 室溫離心 1 分鐘,棄收集管中的穿透液,把離心吸附柱放回到收集管中。此為第二次洗滌,可以跳過(guò)。
9. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘(干甩),棄含穿透液的離心管。
10. 將干甩后的離心吸附柱套入到一個(gè)自備的 RNase-free 的 1.5 mL 離心管中,在離心吸附柱的濾膜的中部加入 30-100 uL DNA 洗脫液 3.0,然后室溫放置 2 分鐘。
11. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘,離心管中的溶液即為病毒 DNA 溶液。
12. DNA 樣品可以直接用于 PCR,也可放-20℃長(zhǎng)期保存。
注:病毒提取的核酸量遠(yuǎn)不足以電泳檢測(cè),提取后可通過(guò) PCR 檢測(cè),最終靈敏度可以達(dá)到 30-50 拷貝/mL。
Q:提取液體樣品/病毒核酸(RNA 或 DNA)為何很難?
A:原因一是量少。病毒顆粒中的 RNA 或 DNA 是作為遺傳物質(zhì)保存,每個(gè)病毒最多
只攜帶幾個(gè)拷貝(而一個(gè)細(xì)胞中有上萬(wàn)種 RNA 分子,每種 RNA 有很多拷貝),同時(shí)
其長(zhǎng)度也十分有限(一般不到細(xì)胞基因組的萬(wàn)分之一),樣品中病毒數(shù)往往又不是很
多,使得樣品中病毒核酸的絕對(duì)量往往比一個(gè)細(xì)胞中核酸的絕對(duì)量還少,所以操
作中十分容易丟失。另外,由于得到的核酸絕對(duì)量很少,不能使用電泳和測(cè) OD
檢測(cè),只能通過(guò) PCR 或 RT-PCR 檢測(cè),而 PCR 或 RT-PCR 的條件又需要優(yōu)化,
所以要確定提取是否成功十分不容易。
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