柱式動物線粒體 DNAOUT，PCR 級 是進(jìn)行分子進(jìn)化研究和母性遺傳研究的重要材料，但傳統(tǒng)的兩步式 mtDNA 提取方法是先溫和裂解細(xì)胞，分離線粒體，然后再從
線粒體中提取 mtDNA。此方法中的溫和裂解細(xì)胞的條件十分難以控制，需要針對不同組織材料單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化。本方法克服了上述缺點(diǎn)，具有下列優(yōu)點(diǎn)：
1. 不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2. 得到的 mtDNA 可以直接用于 PCR。
3. 每 107個(gè)動物細(xì)胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA，每克組織一般能得到 3-5 ug mtDNA。
4. 注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞�粒體 DNA一般都十分巨大，非常難提。
一：培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理
1. 用自備的 0.25%胰酶消化液處理約 107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，離心收集后棄上清。
2. 用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA 提取。
二：組織細(xì)胞預(yù)處理
3. 用剪刀將 1g 新鮮的動物組織剪碎（芝麻大小最好），轉(zhuǎn)移到 1.5mL 塑料離心管中，用于 mtDNA 提取。注意：最好不要使用凍存的動物組織，因
為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破，使其 DNA 釋放出來被胞漿中的 DNA 酶降解，影響回收率。
三：血液預(yù)處理
4. 將 3-5 mL 抗凝外周血靜置 30 分鐘或低速離心 5 分鐘，取白細(xì)胞層。
5. 用自備 PBS 洗滌白細(xì)胞兩次，得到的白細(xì)胞沉淀用于 mtDNA 提取。四：mtDNA 提取
5. 在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入 250 uL 冰浴的溶液 A，充分吹打分散。如果是剪碎的組織，不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入 250 uL 常溫的溶液 B（如果溶液 B 有沉淀，用前須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復(fù)顛倒混勻 10 次。千萬不要?jiǎng)×艺袷帯?/div> 
7. 冰上放置 6-8 分鐘。注意不要超過 8 分鐘。
8. 加入 350 uL 冰浴的溶液 C，溫和混勻 4-6 次，可見白色沉淀物產(chǎn)生，然后放冰上放置 20-25 分鐘。
9. 室溫 12000-15000 g 離心 10 分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大，有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正�，F(xiàn)象，取上清時(shí)避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置 5 分鐘以讓 DNA 與離心吸附柱充分結(jié)合，此步十分重要。
11. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，棄收集管中的廢液。
12. 加入 500 uL 的通用洗柱液，室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，棄收集管中廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復(fù)上步 1 次。
14. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會影響 DNA 的后續(xù)使用（如 DNA 上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中）。
15. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管中，加入 30-50 uL65-80℃預(yù)熱的 DNA 洗脫液，室溫放置 2 分鐘。常溫的 DNA 洗脫液也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。
16. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘，離心管底溶液即 mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合 DNA 能力較強(qiáng)，如果再加 30-50 uL DNA 洗脫液到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多 mtDNA（相當(dāng)于第一次洗脫的 20-30%），但注意不要使用上步得到的 mtDNA 溶液來洗脫。
18. 12000-15000 g 離心 1 分鐘，離心管底溶液即線粒體 DNA。每 107個(gè)動物細(xì)胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA，每克組織一般能得到 3-5 ugmtDNA。如果 DNA 需要濃縮，可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于 DNA 機(jī)械斷裂，電泳時(shí) DNA 可能不呈現(xiàn)專一的帶，但此 mtDNA 溶液可以直接用于 PCR。 線粒體線粒體是合成 ATP 和脂肪酸的細(xì)胞器，每個(gè)細(xì)胞有多個(gè)線粒體，每個(gè)線粒
體有多個(gè)線粒體基因組，例如每個(gè)釀酒酵母(S．cerevisiae)細(xì)胞里有 20 多個(gè)線粒體，人淋巴細(xì)胞有數(shù)個(gè)，肝細(xì)胞有 500-2500 個(gè)，卵母細(xì)胞有上千個(gè)。除少數(shù)低等真核生物線粒體基因組為線狀 DNA 外，其他生物的線粒體基因組都是環(huán)狀 DNA。線粒體基因組缺乏組蛋白，故無核小體。哺乳動物的線粒體基因DNA 沒有內(nèi)含子，幾乎每一對核苷酸都參與一個(gè)基因的組成，有許多基因的序列是重疊的。不同物種的線粒體基因組的大小相差懸殊，在動物中的趨勢是物種越高等，mtDNA 越小。常見物種 mtDNA 的大小列表：
人 mtDNA 只有 D 環(huán)區(qū)(D-loop，參與復(fù)制啟動)和另外 87 個(gè) bp 不是編碼基因外，其余序列共編碼 13 個(gè)蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素 b、細(xì)胞色素氧化酶的 3個(gè)亞基、ATP 酶的 2 個(gè)亞基以及 NADH 脫氫酶的 7 個(gè)亞基）、24 個(gè) rRNA（包括 1 個(gè) 16SrRNA、1 個(gè) 12SrRNA 和 22 個(gè) tRNA）。人類的神經(jīng)肌肉變性疾病如 Leber 氏遺傳性視神經(jīng)病、帕金森病、早老癡呆癥、線粒體腦肌病、母系遺傳的糖尿病和耳聾等都同線粒體基因有關(guān)。與細(xì)胞核 DNA 相比，mtDNA 具有下列特點(diǎn)：①突變率高，是核 DNA 的 10-100 倍左右，有利于檢查出在較短時(shí)期內(nèi)基因發(fā)生的變化，有利于比較不同物種的相同基因之間的差別，確定這些物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系；②母性遺傳(maternal inheritance)，這是由于動物精子的細(xì)胞質(zhì)極少，子代 mtDNA 基本上都是來自卵細(xì)胞，因此具有相同 mtDNA 序列的個(gè)體必定是來自一位共同的雌性祖先。
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