| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 本產(chǎn)品是類似于 TRIzol、基于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取原理的快速總 RNA 提取試劑，可用于從各種動(dòng)物組織（包括白細(xì)胞）和部分植物材料中快速提取總 RNA。 1. 操作簡(jiǎn)單快速，只要 10 分鐘左右，可以全在室溫下進(jìn)行。 2. RNA 質(zhì)量高，OD260/OD280 一般在 1.9 左右。一般不含用 RT-PCR 可以檢測(cè)到的基因組DNA 污染。 3. 適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料，如培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)物材料和少數(shù)植物材料。植物 RNA 的提取最好使用天澤基因的植物 RNAOUT。 4. 性價(jià)比高于進(jìn)口TRIzol 和 TRI Reagent 等同類產(chǎn)品。 | ||||
| 規(guī)格及成分 |
| 成 份 | 編 號(hào) | 小立盒包裝 |
|
| 動(dòng)物 RNAout | 3070A | 100 mL（廣口棕色玻璃瓶） | |||
| 使用手冊(cè) | 3070sc | 1 份 | |||
| 運(yùn)輸及保存 | 常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。 | ||||
| 自備試劑 | 氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。 | ||||
| 使用方法 | 注意：下面的操作步驟是用 1 mL 本產(chǎn)品進(jìn)行的微量提取的，細(xì)胞使用量一定要準(zhǔn)確，不能超過(guò)下述用量，否則將超出本產(chǎn)品的裂解能力，RNA 產(chǎn)量將急劇降低。如果樣品量大，請(qǐng)按比例增加各成份的用量。RNA 工作環(huán)境最好用高效無(wú)毒的固相 RNase 清除劑（CAT#：3080）徹底處理。 1. 對(duì)貼壁細(xì)胞（10 平方厘米）：吸盡培養(yǎng)液，加入 1 mL 的本產(chǎn)品用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第 6 步。 2. 對(duì)懸浮細(xì)胞（五百萬(wàn)至一千萬(wàn)個(gè)）：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，加入 1 mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第 6 步。 3. 對(duì)新鮮組織（50-100 mg）：將新鮮組織剪切成小塊，放入 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中，加入 1 mL 的本產(chǎn)品，用 Polytron 剪切式勻漿器冰上勻漿 30 秒左右，將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 塑料離心管中， 進(jìn)入第 6 步。注意：對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA），使用量不要超過(guò) 30-50 mg，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。對(duì) 10 mg 以下的組織，最好加入本公司的微量 RNA 助沉劑。 | ||||
4. 
對(duì) RNALOCKER 保存的組織（50-100 mg）：先用紙吸去 RNALOCKER 液體后再剪切成小塊，其余操作同第 3 步。RNALOCKER 處理后的組織韌性很強(qiáng)，勻漿時(shí)間需要適當(dāng)延長(zhǎng)。
5. 對(duì)液氮中保存的組織（50-100 mg）：在研缽中研磨成粉，加入 1 mL
本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的
1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第 6 步。
6. 在裝有裂解物/勻漿物的 1.5 mL 塑料離心管中加入0.2 mL 自備氯仿， 振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。注意：一定要把官底的溶液震蕩起來(lái)， 否則只是液面的振動(dòng)。
7. 13000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。
8. 將上清液（約 0.6 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。下層有機(jī)相（藍(lán)色）和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險(xiǎn)起見，可以留下 50-100uL 上清液不取。
9. 對(duì)脂類豐富的組織（如脂肪組織和腦組織），需再重復(fù)氯仿抽提一到兩次以讓氯仿充分去除脂類分子。
10. 在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩 30 秒混勻。
11. 13000-15000 g 室溫離心 5 分鐘，離心底的側(cè)面將形成 RNA 沉淀。如果組織使用量低于 10 mg 或需要提高 RNA 回收率，可以將離心時(shí)間延長(zhǎng)到 20 或 30 分鐘。
12. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。
13. 在含 RNA 沉淀的離心管中加入 1mL 75%乙醇，振蕩混勻 30 秒。
14. 13000-15000 g 室溫離心 1 分鐘。
15. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。
16. 重復(fù)第 13-15 的洗滌步驟一次（也可以省略）。
17. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留乙醇(約 50 uL)。注意不要吸棄 RNA 沉淀。此步十分重要，否則殘留的乙醇會(huì)影響RNA 的后續(xù)使用。
18. 室溫放 1-2 分鐘后立即加入 50-100 uL RNase-free 水使RNA 沉淀溶解。千萬(wàn)不要用真空離心法使 RNA 沉淀過(guò)于干燥，否則 RNA 將變得十分難溶。RNA 樣品可以立即使用或存放于-80℃待用。
注意：由于 RNase-free 水沒有主動(dòng)滅活殘留 RNase 的功能，而任何方法提取的 RNA 都可能有殘留的 RNase，所以強(qiáng)烈建議客戶使用本公司推出的具有主動(dòng)滅活殘留 RNase 功能的、同時(shí)跟后續(xù) RT-PCR 等反
|
| 應(yīng)兼容的液相 RNase 清除劑（CAT#：3091）。 附一：RNA 完整性的電泳檢測(cè)（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑） 如果需要做 Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28： 414，2000）。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè)，可以使用 TAE 緩沖液或超快核酸電泳液進(jìn)行常規(guī)電泳， 但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用 RNAon 這樣的變性上樣液 （BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過(guò)去 RNase 處理，所以最好不要使用，否則 RNA 容易降解。 動(dòng)物 RNA 電泳后應(yīng)該在 UV 下呈現(xiàn)三條清晰的 rRNA 帶，28S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度一般比 18S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng) 1.5-2.3 倍。如果這兩條 rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解（因?yàn)榇蟮?RNA 被酶降解的可能更大）。 跟動(dòng)物一樣，植物果實(shí)和種子的 RNA 一般有三條電泳帶，但植物葉片的 RNA 有四條或更多rRNA 帶，多余的 RNA 來(lái)源于葉綠體。 如果電泳發(fā)現(xiàn) RNA 樣品中有 DNA 污染（一般是使用過(guò)多樣品造成），可分別用天澤基因的非酶DNA 清除劑或 RNase-free DNase 清除。 附二：RNA 產(chǎn)量和純度測(cè)定（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑） 用 pH 在 7.5-8.2 的 TE 緩沖液將 5-10 μL RNA 稀釋 10-20 倍后在 OD260 和 OD260 測(cè)光吸收，通過(guò)光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度×體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。RNA 的產(chǎn)率還隨組織的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不同，一般來(lái)說(shuō)，代謝旺盛的組織(如肝臟和腎臟)RNA 的產(chǎn)率高，代謝不旺盛的組織(如肌肉和脂肪組織)RNA 的產(chǎn)率低，下面是常見動(dòng)物組織 RNA 產(chǎn)率: 肌肉，胎盤和腦組織:1-2 μg RNA/mg 組織肝，胰和腎組織:5-10 μg RNA/mg 組織培養(yǎng)細(xì)胞:5-15 μg/10E6 細(xì)胞 RNA 的純度通過(guò) OD260/OD280 來(lái)確定，一般在 1.8-2.1 之間即算合格。但即使低于此范圍，一般也不會(huì)影響 RT-PCR 等反應(yīng)。 蛋白質(zhì)污染可以通過(guò)酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可 以用天澤基因的多糖清除劑去除。 |
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | RNADOWN、、液相 RNase 清除劑、固相 RNase 清除劑 |
