Bright-Lumi™ II螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Bright-Lumi™ II Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit，Bright-Lumi™ II Firefly Luciferase Assay Kit)，簡稱Bright-Lumi II，是一種無需洗滌或收集細胞的通過化學(xué)發(fā)光法直接測定細胞內(nèi)螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)活性的超高靈敏度、高信號穩(wěn)定性的一步法檢測試劑盒。

本產(chǎn)品是Bright-Lumi™螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(簡稱Bright-Lumi，產(chǎn)品編號為RG051)的不同包裝版本，兩者的檢測效果完全一致。Bright-Lumi為即用型液體，優(yōu)點是無需配制即可以直接使用，缺點是需要-80℃保存，如果在-20℃保存時間較長后檢測效果會逐漸下降；本產(chǎn)品，即Bright-Lumi II，為Bright-Lumi的凍干粉版本，使用前需要使用提供的緩沖液充分溶解底物凍干粉后才能使用，優(yōu)點是在-20℃保存非常穩(wěn)定。

配制好的Bright-Lumi II螢火蟲螢光素酶檢測試劑，按照與培養(yǎng)液等體積的比例加入到細胞培養(yǎng)板內(nèi)反應(yīng)5分鐘，即可進行化學(xué)發(fā)光檢測。本試劑盒使用靈活便捷、檢測靈敏度高、測定樣品的線性范圍寬，性能優(yōu)于國外主要同類產(chǎn)品。另外，本產(chǎn)品也可以用于裂解并收集保存的細胞樣品的檢測。

本產(chǎn)品的性能優(yōu)于國外主要同類產(chǎn)品。本產(chǎn)品的用途與同類產(chǎn)品One-Lumi™螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(簡稱One-Lumi)、Steady-Lumi™螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(簡稱Steady-Lumi)及Promega公司的Bright-Glo™ Luciferase Assay System (簡稱Bright-Glo)基本相同，但本產(chǎn)品的檢測靈敏度顯著優(yōu)于One-Lumi、Steady-Lumi和國外同類產(chǎn)品(Competitor P) (圖1A、C)，發(fā)光強度比國外同類產(chǎn)品(Competitor P)提高了約30%；化學(xué)發(fā)光的信號穩(wěn)定性與國外同類產(chǎn)品(Competitor P)基本一致(圖1B)，但One-Lumi和Steady-Lumi的信號穩(wěn)定性更強(圖1D)。本產(chǎn)品與One-Lumi、Steady-Lumi及國外同類產(chǎn)品(Competitor P)的檢測效果比較參見圖1。

圖1. Bright-Lumi™ II螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Bright-Lumi II)和碧同類產(chǎn)品One-Lumi™螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(One-Lumi)、Steady-Lumi™螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Steady-Lumi)及國外同類產(chǎn)品(Competitor P)對轉(zhuǎn)染陽性螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒的HeLa細胞的檢測效果。Bright-Lumi II與生產(chǎn)的Bright-Lumi™螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Bright-Lumi)的檢測效果完全一致。圖A和圖B為Bright-Lumi 即Bright-Lumi II和Competitor P的化學(xué)發(fā)光強度和化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性的檢測效果對比圖，圖C和圖D為Bright-Lumi即Bright-Lumi II和One-Lumi、Steady-Lumi的化學(xué)發(fā)光強度和化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性的檢測效果對比圖。實際讀數(shù)會因細胞種類、轉(zhuǎn)染效率、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本產(chǎn)品發(fā)光強度高。對于相同的細胞樣品，本產(chǎn)品的發(fā)光效果比國外同類產(chǎn)品(Competitor P)強約20-40% (圖1A)，比One-Lumi強約50-90%，比Steady-Lumi強約4-8倍(圖1C)，實測效果可能會因細胞種類、檢測環(huán)境等的不同有所差異。

本產(chǎn)品的檢測靈敏度高，測定樣品的線性范圍寬。96孔板中，通常本產(chǎn)品可以在20萬個細胞范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。不同的細胞、不同的螢光素酶表達水平時的檢測細胞數(shù)量的上限可能有所差異，當(dāng)螢火蟲螢光素酶表達水平很高時，可能只在10萬個細胞范圍有良好的線性關(guān)系，但是化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會隨著細胞數(shù)量的增加而繼續(xù)升高的。本產(chǎn)品對轉(zhuǎn)染螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒的不同數(shù)量的HeLa細胞的檢測效果參見圖2。

圖2. 本產(chǎn)品對轉(zhuǎn)染螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒的不同數(shù)量的HeLa細胞的檢測效果。根據(jù)共轉(zhuǎn)的EGFP表達質(zhì)粒，實測轉(zhuǎn)染效率約為60-70%。實際讀數(shù)會因細胞種類、轉(zhuǎn)染效率、所用報告基因質(zhì)粒、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本產(chǎn)品操作簡單，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測速度快，完成整個檢測流程僅需約10分鐘。本產(chǎn)品比其它螢光素酶測定方法更加簡單快捷，細胞可以在同一塊多孔板中培養(yǎng)和檢測，無需洗滌細胞，也無需更換或去除培養(yǎng)液，只需用試劑盒提供的檢測緩沖液把檢測底物(凍干粉)充分溶解后配制成Bright-Lumi™™ II螢火蟲螢光素酶檢測試劑后，與培養(yǎng)細胞等體積混合，反應(yīng)5分鐘后即可進行化學(xué)發(fā)光檢測。并且產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號相對比較穩(wěn)定，在反應(yīng)開始后的30分鐘內(nèi)，每分鐘化學(xué)發(fā)光信號下降通常不超過1%。使用可以測定96孔板的化學(xué)發(fā)光的多功能酶標儀通常在2分鐘內(nèi)就可以完成一塊96孔板的檢測。

本產(chǎn)品穩(wěn)定性好。本產(chǎn)品在-20℃可以長期保存，配制成Bright-Lumi™ II螢火蟲螢光素酶檢測試劑后的穩(wěn)定性也非常好，反復(fù)凍融5次對檢測效果無明顯影響，反復(fù)凍融10次檢測效果下降不超過10%。Bright-Lumi™ II螢火蟲螢光素酶檢測試劑在4℃條件下保存3天檢測效果下降不超過20%，保存5天檢測效果下降不超過30%，保存7天仍可保留60%以上的檢測效果。在室溫保存1天可保留70%以上的檢測效果，室溫保存3天可保留55%以上的檢測效果，在37℃保存1天可保留50%以上的檢測效果。Bright-Lumi™ II螢火蟲螢光素酶檢測試劑即使僅保留約50%的檢測效果，仍可以滿足各種常規(guī)檢測。

本產(chǎn)品使用靈活便捷。本產(chǎn)品不僅適合少量樣品的檢測，也非常適合大量樣品的高通量檢測(high-throughput screening)。本產(chǎn)品不僅可以等體積加入到細胞培養(yǎng)孔中進行直接檢測，也可以先使用RG126S/M螢火蟲螢光素酶報告基因細胞裂解液裂解并收集細胞后再用本產(chǎn)品進行檢測。

本產(chǎn)品兼容性強。本產(chǎn)品兼容各種常見培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)液中的酚紅、10%以內(nèi)的胎牛血清或小牛血清、2%以內(nèi)的DMSO或乙醇對信號和穩(wěn)定性基本沒有影響，常用的鹽類或金屬離子在正常濃度下也基本沒有影響。

螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出波長為560nm左右的生物螢光(bioluminescence)。生物螢光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀進行測定。通過螢光素和螢光素酶這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在luciferase的上游，或把3’-UTR區(qū)克隆在luciferase的下游等，構(gòu)建成報告基因(reporter gene)質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，用適當(dāng)藥物等處理細胞后裂解細胞，測定螢光素酶活性。通過螢光素酶活性的高低來判斷藥物等處理對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本試劑盒的檢測原理參考圖3。

圖3. 螢火蟲螢光素酶的檢測原理圖。

三款一步法螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒的主要特點和差異如下。如果希望發(fā)光信號比較強，并在30分鐘內(nèi)即可進行檢測，推薦使用Bright-Lumi；如果對信號穩(wěn)定性要求特別高，需要批量或連續(xù)操作，推薦使用Steady-Lumi；如果對發(fā)光信號和穩(wěn)定性都有要求，推薦使用One-Lumi。對于常規(guī)的實驗室檢測，優(yōu)先推薦使用Bright-Lumi。

螢光素、螢光素酶、螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶也經(jīng)常被稱作熒光素、熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。

對于96孔板，推薦使用100μl細胞培養(yǎng)液和100μl的檢測試劑，總體積為200μl，此時本試劑盒每10ml可以進行100次檢測。對于384孔板，推薦使用25μl細胞培養(yǎng)液和25μl的檢測試劑，總體積為50μl，此時本試劑盒每10ml可以進行400次檢測。也可以用其它體積的試劑進行檢測，但細胞培養(yǎng)液和檢測試劑體積的比例須為1:1。雖然我們有檢測數(shù)據(jù)顯示適當(dāng)減少檢測試劑的用量很可能仍然會得到較好的檢測結(jié)果，但對于細胞數(shù)量偏多、細胞數(shù)量特別少或者重復(fù)性要求比較高的情況，建議按照推薦用量進行檢測。
包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，至少一年有效。檢測緩沖液和檢測底物混合后配制成的Bright-Lumi™II螢火蟲螢光素酶檢測試劑，-80℃避光保存，至少一年有效；-20℃避光保存，推薦3-6個月內(nèi)使用。

注意事項：

對于訂購后可能放置較長時間后再使用的，或者對于檢測結(jié)果的精度要求特別高的，推薦訂購Bright-Lumi™ II；對于訂購后短期內(nèi)使用完畢的，推薦訂購使用更加便捷的Bright-Lumi™。

由于螢光素酶的活性對溫度比較敏感，所以反應(yīng)前細胞和檢測試劑均需達到室溫后再進行測定。可將檢測緩沖液在室溫或不超過25℃的水浴中融解并混勻后再與檢測底物混合成檢測試劑使用。

盡管經(jīng)測試檢測緩沖液和檢測底物混合后配制成的Bright-Lumi™ II螢火蟲螢光素酶檢測試劑反復(fù)凍融5次對于檢測效果無顯著影響，為保證檢測試劑的穩(wěn)定性、取得良好的使用效果，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。沒有用完的檢測試劑可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以避免反復(fù)凍融和長時間暴露于室溫。反復(fù)凍融過程中，可能會導(dǎo)致檢測試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測試不會影響后續(xù)的檢測效果。

請使用適合于細胞培養(yǎng)的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會產(chǎn)生相互干擾。推薦使用的BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)或BeyoGold™全白96孔細胞培養(yǎng)板(FCP968)。

待測藥物的溶劑含量較高時可能會干擾螢光素酶反應(yīng)，從而影響化學(xué)發(fā)光信號�？梢酝ㄟ^設(shè)置含有溶劑的細胞培養(yǎng)液對照孔排除溶劑的干擾。經(jīng)測試，最終反應(yīng)體系中DMSO含量在2%以內(nèi)不會對反應(yīng)產(chǎn)生影響。

為避免細胞轉(zhuǎn)染效率的差異而帶來的誤差，如果有必要，可以同時轉(zhuǎn)染海腎螢光素酶(Renilla luciferase)的報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參，采用的Dual-Lumi™/Dual-Lumi™ II雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(RG088S/RG088M/RG089S/RG089M)進行檢測。

如果希望先裂解并收集細胞樣品，然后再使用本試劑盒進行檢測，須單獨采購RG126S/M螢火蟲螢光素酶報告基因細胞裂解液。其它裂解液未經(jīng)測試。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。