GreenNuc™活細胞Caspase-3活性檢測試劑盒(GreenNuc™ Caspase-3 Assay Kit for Live Cells)是一種使用新型的具有細胞膜通透性的Caspase-3/7綠色熒光底物來檢測活細胞中Caspase-3/7活性的試劑盒，可用于實時檢測活細胞的凋亡情況。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3也稱CPP32、Yama或apopain，有時被寫作Caspase 3或caspase 3，屬于caspase家族的CED-3亞家族(CED-3 subfamily)，是細胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶。Caspase-3是哺乳動物細胞中研究最多的一個caspase。Caspase-3可以剪切procaspase-3、6、7和9，并可以直接特異性剪切許多caspase底物，包括PARP (poly (ADP-ribose) polymerase)、ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、gelsolin和fodrin等。這些由Caspase-3介導的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分。另外，Caspase-3在細胞核凋亡過程中也起到了關(guān)鍵作用，包括染色質(zhì)固縮(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。同時Caspase-3對細胞起泡(cell blebbing)也起到關(guān)鍵作用。
本試劑盒的檢測原理參見圖1。GreenNuc™ Caspase-3 Substrate為耦合DNA綠色熒光染料的多肽DEVD，該底物中的DEVD是caspase 3/7的識別序列，并帶有大量負電荷。這些負電荷和DNA帶有的負電荷相互排斥，使底物中的DNA綠色熒光染料不能結(jié)合DNA，也就不能被激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光。當最初沒有熒光的底物穿過細胞膜進入細胞質(zhì)，在凋亡細胞中被Caspase-3/7識別并剪切，從而釋放出活化的DNA綠色熒光染料分子。當這種DNA綠色熒光染料遷移進入細胞核，并和DNA結(jié)合后，就可以被激發(fā)而產(chǎn)生明亮的綠色熒光。
圖1. GreenNuc™活細胞Caspase-3活性檢測試劑盒的檢測原理圖。
檢測試劑直接加入細胞培養(yǎng)液中，孵育15-30分鐘后即可直接用于熒光顯微鏡、流式細胞儀或熒光酶標儀檢測等進行定性或定量檢測。本試劑盒同時提供了Caspase-3/7的可逆抑制劑Ac-DEVD-CHO，以方便確認本試劑盒的檢測效果。HeLa細胞用本試劑盒檢測細胞凋亡的效果參見圖2。
圖2. HeLa細胞用GreenNuc™活細胞Caspase-3活性檢測試劑盒檢測細胞凋亡的效果圖。未誘導凋亡組觀察不到綠色熒光(最左側(cè)一列)；用10μM Camptothecin(喜樹堿)孵育過夜誘導細胞凋亡，并加入5μM GreenNuc™ Caspase-3 Substrate孵育30分鐘，可以觀察到凋亡細胞細胞核處的綠色熒光(中間一列)；而在誘導凋亡的同時加入20μM Caspase-3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO同時孵育，凋亡陽性的綠色熒光細胞數(shù)量被顯著抑制，說明Caspase-3/7被抑制后，底物不能被剪切，沒有活化的DNA綠色熒光染料進入細胞核并染色基因組DNA (最右側(cè)一列)。
本試劑盒檢測可以實時檢測凋亡情況。傳統(tǒng)的Caspase活性檢測試劑盒，通常需要裂解細胞或組織樣品后進行顯色或熒光檢測，而不能用于活細胞的Caspase活性檢測。通過Western檢測Caspase本身的剪切激活，也只能檢測樣品中的Caspase的平均酶活性�；跓晒鈽擞浀腃aspase抑制劑的檢測技術(shù)(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以進入活細胞檢測Caspase活性，但其熒光探針本身就是不可逆的Caspase抑制劑，所以無法在活細胞中實時檢測Caspase的活力。本試劑盒中的底物不會抑制細胞的凋亡過程，可以實時監(jiān)測細胞凋亡的進度。
本試劑盒是雙功能的：既可以檢測Caspase-3/7的活性，又可以顯示細胞核在凋亡過程中的形態(tài)學變化。在眾多凋亡的細胞內(nèi)，不同細胞可能處在不同時期并經(jīng)歷著凋亡過程中的不同事件，因而研究中很重要的一點就是能實時獨立地跟蹤這些事件，從而更好地了解事件之間的相互關(guān)系。本試劑盒可以和其它一些熒光探針(如線粒體探針、其它凋亡探針)配合，通過熒光顯微鏡、流式細胞儀來研究這些不同事件的時間、空間關(guān)系。
本試劑盒后續(xù)兼容性強：使用本試劑盒檢測后，后續(xù)可以繼續(xù)使用多聚甲醛固定，并進行后續(xù)的各種免疫染色，包括免疫熒光、免疫組化等。
本試劑盒小包裝C1168S如果用于96孔板或流式細胞儀可以進行20-40次檢測，96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以檢測40次，檢測體系體積為200μl時僅可以檢測20次；C1168M可檢測樣品的數(shù)量為小包裝C1168S的5倍。實際檢測次數(shù)會因為檢測體系和使用的底物濃度而有所不同。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1168S-1 | GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM) | 20μl |
| C1168S-2 | Ac-DEVD-CHO (10mM) | 10μl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。GreenNuc™ Caspase-3 Substrate須-20℃避光保存。
注意事項：
本試劑盒染色兼容多聚甲醛或甲醛固定，但與甲醇固定不兼容。建議用4%多聚甲醛固定10-15分鐘，固定后的細胞可以用免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或含有0.1% Triton X-100的適當溶液進行通透處理后進行后續(xù)染色。固定或通透等處理時間過長，對本試劑盒染色的亮度會有一定的影響。
熒光染料有一定的淬滅性，請注意避免長時間在熒光顯微鏡下觀察。
本試劑盒組分須盡量避免反復凍融。如果多次使用，請注意適當分裝。
Ac-DEVD-CHO在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
有文獻報道少數(shù)類型的細胞凋亡檢測不到Caspase-3/7的激活。
本試劑盒染色后，推薦使Hoechst 33342活細胞染色液(100X) (C1027/C1028/C1029)復染，復染后可見所有細胞核呈現(xiàn)明亮的藍色熒光。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
