Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測試劑盒(Myco-Lumi™ Luminescent Mycoplasma Detection Kit)，簡稱Myco-Lumi™，是一種通過化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)的細胞等生物材料中是否有支原體污染的試劑盒。

支原體(Mycoplasma)是最小、最簡單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無細胞壁結構，所以針對細胞壁的許多常見的抗生素，如青霉素或β-內(nèi)酰胺類抗生素對支原體無效；支原體大小介于細菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過0.22μm濾器，常規(guī)的過濾對支原體無效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細胞表面和細胞之間。支原體的這些特征使細胞培養(yǎng)過程中存在支原體污染的風險，細胞的支原體污染已經(jīng)成為一個世界性的普遍問題。
支原體污染可能會嚴重影響細胞的狀態(tài)，使細胞的基因表達、代謝特征發(fā)生變化，導致細胞生長減緩、分化和死亡異常，嚴重影響細胞功能。這些影響因素會嚴重影響實驗結果的可靠性、可重復性和一致性，因此支原體污染的檢測非常重要。
細胞培養(yǎng)過程中的細菌、酵母或霉菌污染在光學顯微鏡下可見，但支原體污染在光學顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進行檢測。檢測支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、特殊的生化檢測、PCR檢測以及DNA熒光染色檢測等。上述檢測方法中，大多操作步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高或所需時間較長。
Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測試劑盒是利用支原體特有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應進行檢測，通過比較檢測試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。整個檢測過程只有兩個步驟，僅需約15分鐘。第一步是在樣品中加入支原體檢測試劑A，5分鐘后進行檢測，讀值為A，此時檢測的是樣品中原有ATP的量；第二步是加入支原體檢測試劑B，10分鐘后進行檢測，讀值為B，此時如果樣品有支原體污染，其特有的酶可以將支原體檢測試劑B中的ADP轉(zhuǎn)換為ATP，此時檢測的就是原有的本底ATP量和由支原體特有酶催化新生成的ATP量的總和。通過計算讀值B與A的比值就可以判斷是否有支原體污染。如果比值大于1.2表示有支原體污染，比值越大說明污染程度越高，如果比值小于0.9說明沒有支原體污染，如果比值介于0.9和1.2之間，建議原細胞(包含原培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時之后再測試一次。本試劑盒檢測支原體的原理參考圖1。
圖1. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測試劑盒檢測支原體的原理。細胞上清中如果含有支原體，加入支原體檢測試劑A后會裂解支原體，支原體中的內(nèi)容物釋放，釋放出的ATP以及細胞上清中的ATP會在螢光素酶催化下產(chǎn)生螢光信號；加入支原體檢測試劑B之后，支原體中特有的酶可以使ADP轉(zhuǎn)換成ATP，生成的ATP可以跟檢測試劑中的螢光素酶反應，產(chǎn)生的螢光信號進一步增加。
本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染，在細胞培養(yǎng)過程中可隨時取少量培養(yǎng)液上清監(jiān)測是否有支原體污染。
本試劑盒螢光信號穩(wěn)定性好，在加入支原體檢測試劑A后，螢光信號穩(wěn)定，在5分鐘時即可檢測；加入支原體檢測試劑B后，如果是無支原體污染樣品，原有螢光信號會有一定程度的下降，而如果是有支原體污染樣品，螢光信號會隨時間延長而增強，10分鐘時即可檢測。
如果發(fā)現(xiàn)有支原體污染，建議更換無污染的細胞進行培養(yǎng)。如果有必要預防或去除支原體，可以使用專用的支原體預防或去除試劑(C0288、C0290、C0292、C0293)。
本試劑盒包含一定量陽性對照，檢測更可靠、便捷。陽性對照不含支原體，無支原體污染風險。建議每次檢測都設置陽性對照。陽性對照也可單獨訂購(C0299 Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測陽性對照)。
對于96孔板，推薦使用50μl細胞培養(yǎng)液或其它樣品，此時本試劑盒C0298S包裝可檢測20個樣品，C0298M包裝可檢測100個樣品。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效；-80℃保存，兩年有效。支原體檢測試劑A (C0298S-1或C0298M-1)需避光保存。
注意事項：
支原體檢測試劑A中含有螢光素酶，反復凍融會導致其逐漸失活。盡管經(jīng)測試反復凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復凍融過程中，可能會導致檢測試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測試不會影響后續(xù)的檢測效果。
陽性對照須避免反復凍融，可適當分裝后保存。
檢測時強烈建議使用白色96孔板，如果使用普通透明的96孔板，相鄰孔之間可能會產(chǎn)生相互干擾。白色96孔板可向雅吉生物訂購(FCP968 BeyoGold™全白96孔細胞培養(yǎng)板)。
當檢測對象是細胞時，需正常培養(yǎng)細胞至少24小時以上，3-6天更佳，然后直接使用未經(jīng)胰酶消化的細胞培養(yǎng)液上清作為樣品；當檢測對象是一些支原體含量極其微量的樣品時，如細胞培養(yǎng)用的血清、胰酶、抗生素、培養(yǎng)液，最好經(jīng)過2-3天的培養(yǎng)后再測試。培養(yǎng)時間過短，很可能會導致本產(chǎn)品無法檢測出支原體污染。如果只能培養(yǎng)較短時間，建議嘗試用PCR法支原體檢測試劑盒(C0301)或其它方法進行檢測。
由于某些貼壁細胞培養(yǎng)液上清中有少量細胞或?qū)τ趹腋〖毎�的培養(yǎng)液，室溫200g離心5分鐘后取上清檢測，否則背景值會比較高。
檢測時請在室溫20-25℃左右進行，否則會影響檢測效果。化學發(fā)光反應和支原體特異性酶催化的反應都受溫度影響，檢測試劑、檢測樣品都必須平衡至室溫才可以進行檢測。
人體皮膚表面有豐富的ATP，檢測時請戴好手套，防止污染試劑。其它耗材也需潔凈、無污染。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.需要用戶自己準備的器材：
a.化學發(fā)光儀(luminometer)或者具有檢測化學發(fā)光功能的酶標儀、和酶標儀配套使用的化學發(fā)光檢測專用的96孔板(白板)。
b.無菌離心管、槍頭及移液槍。
2.試劑和檢測樣品準備：
a.所有試劑使用前要平衡至室溫，最適宜的溫度是20-25℃。
b.檢測樣品準備：取0.2-1ml培養(yǎng)3-6天的細胞上清(培養(yǎng)時間較短的細胞上清也可以檢測，但上清中釋放的支原體較少，檢測靈敏度會顯著下降)，200g (約1500rpm)離心5分鐘以沉淀少量漂浮的細胞或細胞碎片，取上清。上清樣品最好收集后立即檢測，也可以在室溫或4℃放置并當天檢測，或者置于-80℃保存半年內(nèi)檢測。低溫保存的樣品檢測的時候須室溫融化并達到室溫后才可用于檢測。
3.實驗步驟：
a.在檢測板中加入50μl的檢測樣品、陽性對照、陰性對照(如無菌水或PBS、新鮮培養(yǎng)液)。
b.加入50μl的支原體檢測試劑A，混勻，20-25℃放置5分鐘。然后用多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測，即讀值為A。請根據(jù)儀器要求設置相應的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進行適當?shù)恼{(diào)整。
c.加入50μl的支原體檢測試劑B，混勻，20-25℃放置10分鐘。然后用多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測，即讀值為B。注：請嚴格按照加入支原體檢測試劑B后10分鐘進行檢測，切勿提前或延后，否則可能會影響比值在臨界值附近樣品的結果判斷。
d.計算比值(Ratio)=讀值B/讀值A。參考表1，比值大于1.2說明有支原體污染，比值小于0.9表示沒有支原體污染，比值在0.9-1.2之間可以將原樣品繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后重新檢測。
表1. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測試劑盒的結果分析。

備注1：有些樣品如添加了特殊藥物或使用某些特殊培養(yǎng)液，可能含有抑制或增強反應的成分而導致假陰性或假陽性，此時可以將樣品稀釋10倍后再進行檢測，并進一步根據(jù)稀釋后測定出來的B/A比值來判定是否有支原體污染。
備注2：本試劑盒可以檢測出常見的44種支原體污染(具體見附錄)，但是不能具體區(qū)分是何種支原體污染。如需鑒定污染支原體種類，請選用PCR法支原體檢測試劑盒(C0301)。
e.本試劑盒用于檢測一些常見樣品的示例結果請參考表2。陽性對照(Positive Control)為試劑盒中提供的陽性對照，常用溶劑(Common Solvents)為超純水(Water)和PBS，常用細胞培養(yǎng)液(Common Culture Medium)為RPMI-1640和DMEM，陽性樣品(Positive Samples)為支原體污染的HeLa細胞培養(yǎng)上清(其中10倍稀釋為按1:9用PBS稀釋)，陰性樣品(Negative Samples)為無支原體污染的Hep G2和293T細胞培養(yǎng)上清。本試劑盒提供的陽性對照，由于反復凍融導致部分失活等因素，實際測定出來的比值可能會和表2和圖2中所列數(shù)據(jù)有較明顯的偏差。而超純水、PBS、RPMI-1640和DMEM檢測出來的比值數(shù)據(jù)和所列數(shù)據(jù)會相對比較接近。實際測定出來的讀值A和B，不同的儀器設備可能會有非常大的差別。
表2. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測試劑盒檢測數(shù)據(jù)示例。

圖2. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測試劑盒檢測數(shù)據(jù)分析。
附錄：本試劑盒檢測支原體種類參考表

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