冠狀病毒Mpro/3CLpro活性熒光檢測試劑盒(Coronavirus Mpro/3CLpro Activity Fluorometric Assay Kit)是一種用熒光法快速高靈敏檢測冠狀病毒主蛋白酶(main protease, 簡稱Mpro，也稱3C-like protease，簡稱3CLpro)活性的試劑盒。

2019年底由新型冠狀病毒引起的肺炎疫情，從2020年初開始在全球大流行，感染病例快速上升，引發(fā)全球關(guān)注。該病毒被世界衛(wèi)生組織(WHO)命名為2019-nCoV，被國際病毒分類委員會命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠狀病毒導(dǎo)致的疾病，被世界衛(wèi)生組織正式命名為冠狀病毒疾病2019 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19），通常稱為新型冠狀病毒肺炎，簡稱“新冠肺炎”。

新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于單正鏈的RNA病毒，與SARS-CoV以及MERS-CoV具有較高的同源性，該病毒感染進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在宿主細(xì)胞的幫助下，其遺傳物質(zhì)RNA的ORF1a/b首先翻譯表達(dá)出兩條多聚蛋白前體(pp1a和pp1ab)，多聚蛋白前體在主蛋白酶(main protease, 簡稱Mpro)和木瓜樣蛋白酶(papain like proteases)的作用下發(fā)生分子內(nèi)的切割產(chǎn)生多個非結(jié)構(gòu)蛋白。Mpro也被稱為3C-like protease (3CLpro)，因為其切割位點的特異性與微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，兩者并稱為Mpro/3CLpro。多聚蛋白前體產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白參與了病毒亞基因RNA和四個結(jié)構(gòu)蛋白(envelope/E蛋白、membrane/M蛋白、spike/S蛋白和nucleocapsid/N蛋白)的產(chǎn)生，進(jìn)而完成子代病毒的繁衍與釋放。由于Mpro蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至關(guān)重要的作用，且人體內(nèi)沒有同源蛋白，故Mpro主蛋白酶是一個抗病毒藥物研發(fā)的理想靶點。

2019-nCoV Mpro/3CLpro與SARS-CoV Mpro/3CLpro只差12個氨基酸，同源性大于96%，兩者結(jié)構(gòu)基本一致，本試劑盒中使用的陽性對照2019-nCoV Mpro/3CLpro是采用自主研發(fā)的PerfectProtein™蛋白表達(dá)技術(shù)平臺純化而來，使表達(dá)的重組2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白沒有任何額外的標(biāo)簽，沒有任何一個額外的氨基酸，確保與2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致，便于檢測體系的建立和酶活的比較。

冠狀病毒Mpro/3CLpro活性檢測試劑盒采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其檢測原理如下。MCA是熒光供體(Donor)，Dnp是熒光受體(Acceptor)或稱為淬滅基團(tuán)(Quencher)，這兩個熒光基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個熒光基團(tuán)間的距離合適時(一般7-10nm)，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。MCA和Dnp被連接到Mpro/3CLpro蛋白酶的天然底物(Substrate)，即MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 (P9731)的兩端。當(dāng)Mpro/3CLpro蛋白酶沒有切割該底物時，兩個基團(tuán)足夠接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，即Dnp可淬滅MCA熒光而檢測不到熒光；當(dāng)該底物被Mpro/3CLpro蛋白酶切割后，多肽的首尾兩端分離，兩個基團(tuán)分開，MCA熒光不再被Dnp淬滅，即可檢測到MCA熒光，這樣通過熒光檢測就可以非常靈敏地檢測Mpro/3CLpro蛋白酶的酶活性。MCA的最大激發(fā)波長為325nm，最大發(fā)射波長為393nm。本試劑盒的檢測原理請參考圖1。

圖1. 冠狀病毒Mpro/3CLpro活性熒光檢測試劑盒檢測原理圖。

本試劑盒內(nèi)提供了MCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，MCA標(biāo)準(zhǔn)品在0.2-50μM范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系�？梢酝ㄟ^設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中Mpro/3CLpro蛋白酶的活性。

本試劑盒可以檢測不同類型樣本的冠狀病毒Mpro/3CLpro酶活力，包括新冠病毒、含新冠病毒的細(xì)胞或動物組織、表達(dá)Mpro/3CLpro酶的細(xì)胞或組織裂解液或純化的Mpro/3CLpro酶等。

用于96孔板檢測時，本試劑盒小包裝P0313S可以進(jìn)行100次檢測，本試劑盒中包裝P0313M可以進(jìn)行500次檢測。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。其中P0313-3 Substrate和P0313-4 MCA Standard (10mM)需避光保存。

注意事項：

Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需要完全解凍并平衡至室溫后再使用，否則可能會影響檢測結(jié)果。2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml)的使用應(yīng)在冰上進(jìn)行。使用完畢后各試劑應(yīng)立即按照試劑盒要求的條件保存。

請確保樣品pH值在7-8之間，或加入樣品后反應(yīng)體系的pH值在7-8之間，否則可能會影響檢測結(jié)果的信號值和穩(wěn)定性。

待測樣品裂解液是指裂解和稀釋待測樣品所用的裂解液，即病毒裂解液或含病毒的細(xì)胞、組織裂解液的稀釋液，該溶液可能會對檢測產(chǎn)生干擾，推薦用本試劑盒提供的Assay Buffer為溶劑稀釋待測樣品。體積較少的試劑首次使用時建議先離心數(shù)秒使液體沉降于管底，然后再使用。結(jié)凍的試劑必須完全融化并混勻后使用。

檢測時建議使用96孔黑板，推薦選購BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.試劑盒的準(zhǔn)備：
融解Assay Buffer、Substrate和MCA Standard并平衡至室溫，輕輕混勻后Substrate和MCA Standard略離心使溶液積聚于管底。使用完畢后宜立即-20℃保存。
2.陽性對照的準(zhǔn)備。
根據(jù)實驗?zāi)康幕蛘邊⒖紙D2B取適量的2019-nCoV Mpro/3CLpro稀釋至一定的濃度。例如取1μl 2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml )，加入19μl Assay Buffer，混勻，即得50μg/ml的2019-nCoV Mpro/3CLpro。反應(yīng)體系中若加入10μl 50μg/ml的2019-nCoV Mpro/3CLpro，則2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白量為0.5μg。
3.MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混勻，即為200μl 100μM的MCA溶液，分別取0、0.5、1、2、4、6、8、10μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer補(bǔ)足至100μl，此時，MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的各孔MCA分別為0、0.5、1、2、4、6、8、10μM或0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1nmol。也可自行設(shè)置各孔MCA濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)定。
4.檢測體系的設(shè)置：
參照下表依次加入試劑盒各組分及樣品。初次檢測時，待測樣品可以稀釋一系列濃度梯度，確保最終檢測值在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。待測樣品的稀釋倍數(shù)記為dil。

注1：待測樣品裂解液是指用于裂解和稀釋待測樣品所用的溶液，即病毒裂解液或含病毒的細(xì)胞、組織裂解液的稀釋液。
注2：為獲得更加可靠的檢測結(jié)果，推薦每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。
5.檢測：
a.振蕩混勻1-2分鐘，確�；旌铣浞�。
b.除MCA標(biāo)準(zhǔn)品孔外每孔加入2μl Substrate，混勻。注：加入Substrate后反應(yīng)會立即開始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時間差而導(dǎo)致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進(jìn)行。
c.混勻后立即使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光測定。設(shè)置熒光酶標(biāo)儀溫度為37℃，激發(fā)波長為325nm，發(fā)射波長為393nm。每1分鐘讀取一次數(shù)值。
注1：連續(xù)測定的時間可以根據(jù)待測樣品中Mpro/3CLpro的酶活性進(jìn)行調(diào)整，但是需確保獲得6個點以上的數(shù)據(jù)。對于Mpro/3CLpro的酶活較高的樣品，建議測定總時間為5分鐘或10分鐘，對應(yīng)的測定間隔時間設(shè)為30秒或1分鐘；對于Mpro/3CLpro的酶活很低的樣品，可以延長測定總時間為10、15或者20分鐘，對應(yīng)的測定間隔時間設(shè)為2、3或4分鐘。也可以連續(xù)測定20分鐘，每隔1分鐘測定1次。
注2：本試劑盒中的2019-nCoV Mpro/3CLpro活性較高，反應(yīng)較為迅速，約5分鐘已經(jīng)反應(yīng)完全。
注3：如果熒光酶標(biāo)儀沒有溫控功能，也可以在室溫測定，但這樣檢測出來的是室溫條件下的酶活性，此時酶活性可能會偏低一些，不同的酶偏低的程度會有所不同。
6.計算：
a.計算每個樣品孔和空白對照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對照、RFU陽性對照和RFU待測樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。選取待測樣品組MCA熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系的時間點的數(shù)據(jù)用于分析，記錄呈線性關(guān)系的時間間隔為T，時間間隔T內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化量為ΔRFU，即ΔRFU= RFU待測樣品(Time b) - RFU待測樣品(Time a)。
b.也可以直接比較各個樣品在一定時間內(nèi)的ΔRFU而確定樣品的Mpro/3CLpro相對活性，但須確保最終時間點時RFU讀數(shù)未達(dá)平臺。
c.也可將標(biāo)準(zhǔn)曲線各孔的熒光值減去標(biāo)準(zhǔn)品零濃度孔的熒光值，建立MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔRFU代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可算出在反應(yīng)時間內(nèi)樣品中MCA的生成量(記錄為A)。MCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線請參考圖2A，MCA在0-1.3nmol范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。Mpro/3CLpro蛋白酶活性的計算公式如下：
Mpro/3CLpro Activity (nmol/min/ml或mU/ml)= A × dil/ (Vsample × T)
注：Vsample 為檢測時待測樣品的體積(Vsample=10μl=0.01ml)
dil為步驟4中稀釋倍數(shù)
T為步驟6a中反應(yīng)時間(min)
A為步驟6c中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得的MCA產(chǎn)物量(nmol)
酶活力單位U (Unit)的定義為：在pH7.0，溫度37℃條件下，每分鐘催化生成1μmol MCA-AVLQ的酶量定義為一個單位。本試劑盒中提供的2019-nCoV Mpro/3CLpro的酶活力≥300U/g (即≥300μmol/min/g)。
圖2. 冠狀病毒Mpro/3CLpro活性熒光檢測試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線和2019-nCoV Mpro/3CLpro陽性對照檢測效果圖。本試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖見圖A。不同量的2019-nCoV Mpro/3CLpro酶切底物生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度示意圖見圖B。實際檢測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。​