Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)，也稱E. coli Uracil-DNA Glycosylase (UDG)或E. coli Uracil N-Glycosylase (UNG)，即大腸桿菌UDG或UNG，可催化含尿嘧啶的DNA鏈中的尿嘧啶(dU)堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵發(fā)生水解，從而釋放游離尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有dU的單鏈或雙鏈DNA，但不能水解RNA或含有dU的長度不超過6個堿基DNA寡聚體。
UDG主要應(yīng)用于消除PCR擴(kuò)增過程中帶來的產(chǎn)物污染問題。其防止污染的原理為：在PCR反應(yīng)中加入適量的dUTP，以dUTP替代dTTP摻入DNA中，形成含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；后續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)時，使用UDG酶選擇性切割可能被污染而帶入的之前PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的含有dU的單鏈或雙鏈DNA，從而避免之前的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可能的污染對于本次PCR擴(kuò)增帶來的負(fù)面影響。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of 60 pmol of uracil per minute from double-stranded, uracilcontaining DNA. Activity is measured by release of [3H]-uracil in a 50 µl reaction containing 0.2 µg DNA (104–105 cpm/µg) in 30 minutes at 37℃.
E. coli UDG酶活性鑒定結(jié)果可參考圖1。
圖1.和N公司E. coli UDG酶催化水解5µl含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物效果圖。使用本產(chǎn)品或國外N公司的E. coli UDG，在20µl體系，分別以5µl含dU堿基的1600bp大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為底物和不同量的(0U, 0.0025U, 0.005U, 0.01U, 0.025U, 0.5U) E. coli UDG在1X E. coli UDG Buffer，37℃孵育30min，然后用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。如圖所示，本產(chǎn)品與N公司相比，具有相當(dāng)?shù)拿富�。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
來源：大腸桿菌重組、表達(dá)和純化而獲得。
純度：不含UDG酶活力之外的內(nèi)切或外切脫氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。
用途：防止PCR產(chǎn)物的交叉污染；單核苷酸多態(tài)性檢測(single nucleotide polymorphism detection，GMPD)；位點(diǎn)特異性突變；蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究；SNP基因分型；PCR產(chǎn)物的克�。恢苽浜袉捂溚怀瞿┒说腜CR產(chǎn)物或cDNA。
酶儲存溶液：10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol。
10X E. coli UDG Buffer：200mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 10mM DTT, pH 8.0 at 25℃。
失活或抑制：95℃加熱10分鐘可以使95% E. coli UDG失活。由于經(jīng)95℃加熱10分鐘處理后，其仍保持部分活性，建議加入UDG抑制劑(如來自枯草芽孢桿菌噬菌體PBS2的Ugi蛋白或噬菌體phi29的p56蛋白)進(jìn)一步抑制其酶活以免其繼續(xù)降解含有dU的PCR產(chǎn)物。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7360S-1 | E. coli UDG (5U/µl) | 200µl |
| D7360S-2 | 10X E. coli UDG Buffer | 2ml |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7360M-1 | E. coli UDG (5U/µl) | 1ml |
| D7360M-2 | 10X E. coli UDG Buffer | 10ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
E. coli UDG酶在大多數(shù)PCR反應(yīng)緩沖液體系中均有活性，但對于自行使用的PCR或RT-PCR體系，首次使用時建議先測試一下是否和所使用的體系兼容。通常取含dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，參考圖1加入適量UDG，觀察能否有效降解含dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
dNTP/dUTP推薦選購D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)。
由E. coli UDG酶消化產(chǎn)生的DNA鏈的無堿基位點(diǎn)可通過加熱，堿處理或核酸內(nèi)切核酸酶處理而除去。通常PCR反應(yīng)過程中的加熱步驟可以確保UDG酶消化的位點(diǎn)被完全剪切開。
E. coli UDG酶在比較寬泛的pH范圍內(nèi)具有活性，其最適pH值為8.0，E. coli UDG酶活不需要二價陽離子，并被高離子強(qiáng)度(> 200 mM)所抑制。
E. coli UDG酶可以在PCR反應(yīng)前清除不慎污染的含dUTP的PCR產(chǎn)物，從而避免由于污染導(dǎo)致的PCR假陽性結(jié)果。
E. coli UDG在加熱變性后可能由于重折疊而在較低溫度下表現(xiàn)出殘留活性。因此，建議在退火步驟中使用55℃或更高的溫度進(jìn)行后續(xù)PCR。
E. coli UDG可以用于DNA或cDNA的常規(guī)PCR或qPCR擴(kuò)增體系，但通常不建議用于RT-PCR體系。因?yàn)樵诜崔D(zhuǎn)錄條件下，通常E. coli UDG會保持活性，并可能消化新合成的cDNA。
E. coli UDG酶經(jīng)95℃加熱10min處理后，仍會保持少量活性，如果希望用于RT-PCR體系，需要反轉(zhuǎn)錄和PCR分開進(jìn)行，在反轉(zhuǎn)錄時不使用dUTP，在反轉(zhuǎn)錄后加入E. coli UDG酶處理，然后進(jìn)行常規(guī)的PCR或qPCR，或者建議加入UDG抑制劑(如來自枯草芽孢桿菌噬菌體PBS2的Ugi蛋白或噬菌體phi29的p56蛋白)進(jìn)一步抑制E. coli UDG的酶活性。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作
使用說明：
1.參考下表設(shè)置PCR反應(yīng)體系，或者參考所使用的PCR擴(kuò)增體系設(shè)置PCR體系，并加入E. coli UDG酶至終濃度為0.01U/μl。通常僅加入PCR buffer即可，無需加入UDG的buffer。
| Reagent | Volume | Volume | Final Concentration |
| Nuclease-Free Water | (18.325-x)μl | (36.65-y)μl | - |
| 10X PCR Buffer (with Mg2+) | 2.5μl | 5μl | 1X (1.5mM Mg2+) |
| dNTP/dUTP (2.5mM each/5mM) | 2μl | 4μl | 0.2mM each/0.4mM |
| Primer mix (10μM each) | 2μl | 4μl | 0.8μM |
| Template | xμl | yμl | 10pg-1μg |
| Taq DNA Polymerase (5U/μl) | 0.125μl | 0.25μl | - |
| E. coli UDG (5U/µl) | 0.05μl | 0.1μl | - |
| Total volume | 25μl | 50μl | - |
注1：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，dNTP/dUTP (可購買D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM))的終濃度可在0.2-0.6mM之間調(diào)整。鎂離子的最終終濃度可在1.0-4.0mM之間調(diào)整。
注2：對于25μl的PCR反應(yīng)體系，E. coli UDG (5U/µl)的使用量一般為0.25-0.5U。
注3：模板和引物的用量請參考Taq DNA Polymerase (D7205/D7207/D7209)使用說明或相應(yīng)的PCR體系的產(chǎn)品說明書。
2.參考上述反應(yīng)體系，加入E. coli UDG后混勻，37℃孵育10min (本步驟可以有效去除可能的之前含dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染)，后續(xù)就可以立即進(jìn)入PCR擴(kuò)增程序(須確保退火溫度不低于55℃)。根據(jù)我們的實(shí)際測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在退火溫度不低于55℃的情況下，使用本產(chǎn)品的情況下不會影響PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量。
