Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium)，也稱Heat-labile Bacterial UDG，即熱敏型細(xì)菌UDG，來源于嗜冷海洋細(xì)菌(psychrophilic marine bacterium) BMTU3346，可催化含尿嘧啶的DNA鏈中的尿嘧啶(dU)堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵發(fā)生水解，從而釋放游離尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有dU的單鏈或雙鏈DNA，但不能水解RNA或含有dU的長度不超過6個(gè)堿基DNA寡聚體。
UDG主要應(yīng)用于消除PCR擴(kuò)增過程中帶來的產(chǎn)物污染問題。其防止污染的原理為：在PCR反應(yīng)中加入適量的dUTP，以dUTP替代dTTP摻入DNA中，形成含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；后續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，使用UDG酶選擇性切割可能被污染而帶入的之前PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的含有dU的單鏈或雙鏈DNA，從而避免之前的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可能的污染對(duì)于本次PCR擴(kuò)增帶來的負(fù)面影響。
本產(chǎn)品為熱敏型，在50℃孵育10分鐘可以迅速不可逆滅活。在PCR或RT-PCR反應(yīng)前，PCR或RT-PCR體系中加入Heat-labile Bacterium UDG室溫處理10min，即可充分消除可能的之前的含有dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。本產(chǎn)品不僅適用于PCR，也適用于qPCR、RT-PCR和qRT-PCR等體系。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of 60 pmol of uracil per minute from double-stranded, uracilcontaining DNA. Activity is measured by release of [3H]-uracil in a 50 µl Standard Taq Reaction Buffer containing 0.2 µg DNA (104–105 cpm/µg) in 30 minutes at 37℃.
Heat-labile Bacterial UDG酶活性鑒定結(jié)果可參考圖1。
圖1.Heat-labile Bacterial UDG催化酶解5µl含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物效果圖。使用本產(chǎn)品或國外N公司的酶，在20µl體系，分別以5µl含dU堿基的PCR擴(kuò)增1500bp PCR產(chǎn)物為底物和不同量的(0U, 0.0313U, 0.0625U, 0.125U, 0.25U, 0.5U) Heat-labile Bacterial UDG，在1X Heat-labile Bacterial UDG Buffer，37℃孵育30min，然后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如圖所示，本產(chǎn)品與N公司相比，具有相當(dāng)?shù)拿富睢, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
Heat-labile Bacterial UDG經(jīng)滅活處理后酶活鑒定結(jié)果可參考圖2。
圖2.Heat-labile Bacterial UDG以及E. coli UDG (D7360)經(jīng)50℃10min處理后，催化酶解5µl含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物效果圖。將不同量的E. coli UDG (0U, 0.005U, 0.01U, 0.025U)和不同量的Heat-labile Bacterial UDG (0U, 0.0625U, 0.125U, 0.25U)經(jīng)50℃處理10min之后，在20µl體系，分別以5µl含dU堿基的PCR擴(kuò)增1500bp PCR產(chǎn)物為底物，在1X Heat-labile Bacterial UDG Buffer，37℃孵育30min，然后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如圖所示，E. coli UDG 50℃處理10min之后酶活僅輕微下降，而Heat-labile Bacterial UDG均完全滅活。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
來源：大腸桿菌重組、表達(dá)和純化而獲得。
純度：不含UDG酶活力之外的內(nèi)切或外切脫氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。
用途：去除單鏈或雙鏈DNA尿嘧啶堿基；去除含dU的PCR產(chǎn)物氣溶膠污染；在二代測(cè)序(NGS)應(yīng)用中，主要用于mRNA定向測(cè)序文庫的構(gòu)建；用于提高定向誘變方法的效率和用來獲得高度標(biāo)記的寡核苷酸探針；用于PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR體系。
酶儲(chǔ)存溶液：20mM Tris-HCl (pH 7.5), 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) glycerol。
10X Heat-labile Bacterial UDG Buffer：100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, pH 8.3 at 25℃。
失活或抑制：50℃加熱10min可以使Heat-labile Bacterial UDG完全失活。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7362S-1 | Heat-labile Bacterial UDG (1U/μl) | 100µl |
| D7362S-2 | 10X Heat-labile Bacterial UDG Buffer | 500µl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7362M-1 | Heat-labile Bacterial UDG (1U/μl) | 500µl |
| D7362M-2 | 10X Heat-labile Bacterial UDG Buffer | 2.5ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
Heat-labile Bacterial UDG酶在大多數(shù)PCR或RT-PCR體系中均具有活性，但對(duì)于自行使用的PCR或RT-PCR體系，首次使用時(shí)建議先測(cè)試一下是否和所使用的體系兼容。通常取含dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，參考圖1加入適量UDG，觀察能否有效降解含dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本產(chǎn)品會(huì)被高離子強(qiáng)度(>100mM)所抑制。
dNTP/dUTP推薦選購D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)。
Heat-labile Bacterial UDG酶對(duì)雙鏈DNA的活性低于對(duì)單鏈DNA的活性，對(duì)小的U-DNA寡核苷酸和dUMP有活性，但對(duì)RNA或正常的不含dUTP的DNA沒有活性。
Heat-labile Bacterial UDG酶活對(duì)于金屬離子沒有依賴性，在Mg2+或EDTA的存在情況下均具有活性。
由Heat-labile Bacterial UDG酶消化產(chǎn)生的DNA鏈的無堿基位點(diǎn)可通過加熱，堿處理或核酸內(nèi)切核酸酶處理而除去。通常PCR反應(yīng)過程中的加熱步驟可以確保UDG酶消化的位點(diǎn)被完全剪切開。
Heat-labile Bacterial UDG酶可以在PCR反應(yīng)前清除不慎污染的含dUTP的PCR產(chǎn)物，從而避免由于污染導(dǎo)致的PCR假陽性結(jié)果。
如果需要將Heat-labile Bacterial UDG酶應(yīng)用于One-Step RT-PCR或者One-Step qRT-PCR體系，需要選擇耐熱反轉(zhuǎn)錄酶，并需要將逆轉(zhuǎn)錄溫度設(shè)置為50-55℃。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.按照常規(guī)反應(yīng)體系設(shè)置PCR或RT-PCR反應(yīng)體系，同時(shí)加入Heat-labile Bacterial UDG至最終濃度為0.02U/μl，混勻。通常僅加入PCR或RT-PCR的buffer即可，無需加入U(xiǎn)DG的buffer。
2.25℃孵育5-10min (去除可能的含dUTP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染)，隨后進(jìn)入PCR或RT-PCR程序。
