III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，即 III M-MLV reverse transcriptase，是一種經(jīng)過改造和優(yōu)化的快速高效(短至10min完成反轉(zhuǎn)錄)、熱穩(wěn)定(高達55℃)、高精確度、產(chǎn)物超長(長達12kb)的反轉(zhuǎn)錄酶，具有正常的依賴于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能夠以RNA或DNA為模板，在引物存在的情況下進行互補DNA鏈的合成，即可以進行cDNA(complementary DNA)的第一鏈合成。同時本反轉(zhuǎn)錄酶保留了RNase H活性，能選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA，有利于后續(xù)cDNA第二鏈的合成。
本產(chǎn)品是最常用的優(yōu)質(zhì)反轉(zhuǎn)錄酶之一，廣泛用于獲得總RNA或mRNA后cDNA第一條鏈的合成，后續(xù)可以用于PCR、real-time PCR也稱定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二鏈合成以及cDNA文庫的構(gòu)建，尤其是逆轉(zhuǎn)錄所得目的基因的克隆等。 III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶還可以通過反轉(zhuǎn)錄用于DNA探針的熒光、生物素、地高辛或同位素標(biāo)記等，也可以通過引物延伸(primer extension)來分析和研究RNA。
M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)，也稱MMLV或M-MuLV；反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)也稱逆轉(zhuǎn)錄酶或RT酶。
本產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄快速高效，普通反轉(zhuǎn)錄僅需10min。實測小于3kb的片段，42℃反轉(zhuǎn)錄10min即可完成，與反轉(zhuǎn)錄60min相比無顯著差別。大于3kb的片段，特別是大于6kb的片段，推薦反轉(zhuǎn)錄60min，以獲得最佳的反轉(zhuǎn)錄效果。
本產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度超長。本產(chǎn)品經(jīng)測試可以輕松完成長度為8 kb以下基因的反轉(zhuǎn)錄(參考圖1)，反轉(zhuǎn)錄的最大長度可以達到12 kb。
圖1. 使用 III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄總RNA后，對于不同長度的cDNA進行PCR擴增后的電泳效果圖。圖中可見0.2-12kb的cDNA可以非常高效地被反轉(zhuǎn)錄。
本產(chǎn)品熱穩(wěn)定性好，反轉(zhuǎn)錄效率高。本產(chǎn)品最適反應(yīng)溫度為42℃，當(dāng)溫度達到50℃時仍具有很高活性，對于長度較短的cDNA反轉(zhuǎn)錄，溫度達到55℃時也可獲得較高產(chǎn)量的cDNA。高溫反轉(zhuǎn)錄對于高GC含量RNA的反轉(zhuǎn)錄，能有效減少二級結(jié)構(gòu)，提升反轉(zhuǎn)錄效率。本產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄速度快，6kb以下的cDNA反轉(zhuǎn)錄只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反轉(zhuǎn)錄10min即可完成(參考圖2)。
圖2. BIII M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶在不同溫度反應(yīng)不同時間的反轉(zhuǎn)錄效果。從HEK293T細胞抽提獲得的總RNA 2µg，在20μl反轉(zhuǎn)錄體系中按照圖中所示溫度、時間進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR擴增和電泳。
本產(chǎn)品性價比高。III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶是一種大腸桿菌重組高表達的反轉(zhuǎn)錄酶，由于其表達量非常高，大大提高了本產(chǎn)品的性價比。本反轉(zhuǎn)錄酶為表達含有從Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase基因克隆的pol基因，并進行了多個突變優(yōu)化以提高其熱穩(wěn)定性、反轉(zhuǎn)錄效率、反轉(zhuǎn)錄長度和表達量。
酶活性定義：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTTP into acid-precipitable material in 10 min at 37℃ using poly(A)•oligo(dT)12-18 as template-primer。反應(yīng)體系為 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5mM [3H]-dTTP and 0.4 mM polyA•oligo(dT)12-18。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以滿足常規(guī)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈等的需要。
酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01%(v/v)
NP-40 and 50%(v/v) glycerol。
失活或抑制：80℃孵育10分鐘可以導(dǎo)致 III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對 III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用。
本產(chǎn)品中M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為200U/µl，用于體積為20μl的反轉(zhuǎn)錄體系時，本試劑盒的不同包裝足夠分別進行50次、250次和1000次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7176S-1 | III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 | 50μl |
| D7176S-2 | Reaction Buffer (5X) | 0.3ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
對于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品的使用說明中給予了特別說明，請予以關(guān)注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. cDNA第一條鏈的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 參考如下表格中設(shè)置的20μl反轉(zhuǎn)錄體系(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可從訂購)：
| 模板（右側(cè)3種任選其中一種） | Total RNA | 0.1 ng-5 μg |
| 或poly(A) RNA/mRNA | 10 pg-0.5 μg | |
| 或specific RNA | 0.01 pg-0.5 μg | |
| 引物（右側(cè)3種任選其中一種） | Oligo(dT)18 primer | 0.5 μg(或100 pmol) |
| 或 Random Hexamer primer | 0.2 μg(或100 pmol) | |
| 或 gene-specific primer | 15-25 pmol | |
| DEPC-treated Water | － | To 13.7μl* |
| 選擇性步驟：如果模板RNA的GC含量較高(例如大于55%)或者有比較嚴重的二級結(jié)構(gòu)，混勻后微離心以把液體沉降至管底，65℃孵育5min，隨后立即置于冰上冷卻，以打開RNA中一些比較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。 | ||
| Reaction Buffer (5X) | － | 4 μl |
| RNase Inhibitor (40U/μl) | － | 0.5 μl |
| dNTP Mix (25mM each) | － | 0.8 μl** |
| III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 | － | 1 μl |
| 總體積 | 20μl | |
*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。
**dNTP濃度不同時使用的體積需作適當(dāng)調(diào)整，此時DEPC-treated Water的用量需適當(dāng)調(diào)整。
b. 輕輕混勻(用移液器輕輕吹打混勻或用渦旋混合器在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)18或基因特異性引物，42℃孵育10-60 min。如果使用random hexamer(隨機六聚體)作為引物，先在25℃孵育10 min，隨后在42℃孵育10-60 min。反轉(zhuǎn)錄3kb以下的cDNA，反轉(zhuǎn)錄10min即可，反轉(zhuǎn)錄3-6kb的cDNA，反轉(zhuǎn)錄30min即可，而6kb以上的cDNA推薦反轉(zhuǎn)錄60min。當(dāng)使用random hexamer(隨機六聚體)作為引物，并且后續(xù)用于qPCR時，后續(xù)檢測任何長度的基因，均反轉(zhuǎn)錄10min就足夠了。注意：對于GC含量較高或二級結(jié)構(gòu)比較嚴重的模板RNA，可以50℃孵育60min，以充分利用本產(chǎn)品在50℃時仍有良好的反轉(zhuǎn)錄酶活性這一特點，在較高溫度進行反轉(zhuǎn)錄可以有效減少二級結(jié)構(gòu)的干擾。
d. 80℃孵育10 min以失活 III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。說明：對于5kb以上的長片斷cDNA不推薦采用加熱的方法失活反轉(zhuǎn)錄酶，該方法易導(dǎo)致部分長片斷DNA被剪切，此時可考慮酚氯仿抽提或柱純化方法。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR反應(yīng)等，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應(yīng)時，如果PCR的反應(yīng)體系為20μl和50μl，則推薦相應(yīng)地使用0.8μl和2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 引物延伸、探針標(biāo)記等其它用途請自行參考M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的相關(guān)文獻資料進行。
常見問題：
1. 總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
a. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，并且總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小很不均勻，因此通�？俁NA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
a. PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設(shè)計欠佳，當(dāng)然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。
b. 模板RNA發(fā)生了降解。哺乳動物細胞或組織的總RNA瓊脂糖電泳后應(yīng)該可以看到清晰的18S和28S rRNA條帶，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例應(yīng)該大于等于2.0。如果比例小于2.0，則提示總RNA發(fā)生了顯著的降解，最好能重新制備總RNA樣品。避免RNA降解的主要方法是，嚴格進行RNA的相關(guān)操作，包括帶潔凈手套、戴一次性口罩、在潔凈環(huán)境中抽提或制備RNA，以盡量避免RNase污染。
c. 模板RNA的純度偏低。在提取純化RNA的過程中，殘留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍鹽、磷酸、焦磷酸、多胺、亞精胺等會抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性。對RNA樣品進行柱純化，或者進行沉淀、洗滌和再溶解，通�？梢杂行コ龤埩舻奈廴疚铩Ｍǔ＿x擇使用BeyoZol或Trizol抽提獲得的總RNA完全可以滿足反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要。
d. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板量不足。在抽提獲得總RNA后，在進行一些精細的定量檢測時通常會進行DNase I消化，以充分去除可能的殘留的DNA的干擾。DNase I進行熱失活時，需要加入EDTA至終濃度為2.5mM，否則RNA在沒有螯合劑的情況下，在加熱過程中容易被水解，從而導(dǎo)致模板量不足。此外，擴增特定基因時，需要先查詢該基因的組織分布特點，利用其高表達的組織進行目的基因的反轉(zhuǎn)錄和克隆。用該基因豐度極低的組織或細胞樣品進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，通常會由于模板量過少而PCR擴增失敗。
e. 沒有使用適當(dāng)?shù)姆崔D(zhuǎn)錄引物。對于細菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特異性反轉(zhuǎn)錄引物時，需要確�；蛱禺愋砸镌O(shè)計合理正確。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二級結(jié)構(gòu)，此時可以考慮把反轉(zhuǎn)錄溫度提高到45-55℃
