產(chǎn)品及特點
植物線粒體是重要的植物細胞器，負責 ATP 的產(chǎn)生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟線粒體相關，是母系遺傳研究的重要材料。對植物線粒體進行生化和遺 傳研究都需要進行線粒體純化。本產(chǎn)品就是專門用于植物細胞線粒體純化的試劑盒， 它具有下列特點：
1.即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。
2.提供粗提和精提兩種操作方案，粗提利用常規(guī)臺式冷凍離心機的差速分離原理進行線粒體粗提，所得線粒體含少量其他細胞器污染，可用于后續(xù)的 SDS-PAGE， Western，ELSIA 和蛋白組分析，也可以用于 PCR 級別的線粒體 DNA 和 RNA 提取。
3.精提利用冷凍超速離心（離心力達 40000g）制備的密度梯度來將粗提制備的線粒體和其他細胞成分進一步分開，得到線粒體精提液，適用于后續(xù)的偶聯(lián)分析、 體外 線粒 體蛋 白合 成、線 粒體 成份 定位 等精細 實驗 。也 可用 于后續(xù) 的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析和測序級別的線粒體 DNA 和 RNA 提取。
4.本產(chǎn)品足夠 5 次提取，每次可處理 10g 綠色植物組織（可得 1-2.5 mg 左右線粒體）或 20g 非綠色植物組織（可得 2-5 mg 左右的線粒體）。
| 成分 | 編號 | 大紙盒包裝 |
| 勻漿液 | 111208A | 250 mL |
| 洗滌液 | 111208B | 250 mL×2 |
| 離心介質(zhì)溶液 | 111208C | 150 mL |
| Percoll | 17-0891-09 | 50 mL |
| BSA 干粉 | 9048-46-8 | 10g |
| 帶柄尼龍篩 | --- | 1 只 |
| 軟毛筆 | --- | 1 只 |
| 使用手冊 | 111208sc | 1 份 |
自備試劑
超純水，可能需要 5 M KOH 調(diào) pH，如果需要去除細胞核 DNA，還需要自備 25mM MgCl2 溶液、0.5M EDTA 溶液、DNase 干粉和另購更多洗滌液。
使用方法
注意：線粒體膜對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進行，所用植物組織，器皿和溶液均需要在 4℃預冷。任何情況下線粒體的溫度都不要超過 4℃。
一：選擇組織
1.植物組織不同，線粒體產(chǎn)率不同，請以下表為參考：
| 植物組織種類 | 線粒體產(chǎn)率 | 說明 |
| 根和塊莖 | 0.3 mg/10g | 如土豆，紅薯等 |
| 黃化苗（下胚軸、子葉、胚芽鞘） | 2-5 mg/10g | 多酚含量低于葉片 |
| 有光合作用的葉片和子葉 | 1-2.5 mg/10g | 需放置在暗處 3 天 |
2.一般純化最好選用用黃化苗。如果用綠色組織（如葉片），需將植物提前放在暗室至少 3 天以降低淀粉含量，否則淀粉顆粒將干擾線粒體的純化。
3.一次實驗需要 40 mL 勻漿液、約 90 mL 洗滌液和 35 mL 密度梯度離心介質(zhì)（配制方式是一次性將 9.8g (8.7mL) Percoll 加入到 26.3mL 離心介質(zhì)溶液中，充分混勻后得到 35mL 密度梯度離心介質(zhì)）。這三種溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其終濃度為 0.1%（100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉，輕柔顛倒混勻或攪拌溶解后放冰上預冷待用）。每次實驗用多少配多少，不要預先將所有 BSA 干粉加入， 否則容易長菌。
二：線粒體粗提操作流程
1.將 10 g 的綠色植物組織（如去葉脈后的嫩葉子，愈傷組織）或 20 g 干凈的非綠色植物組織（如發(fā)芽組織、根、塊莖等）浸泡在冰水中 10 分鐘，用紙吸干液體后浸泡在預冷的 40 mL 勻漿液（需先加 0.1% BSA）中，在浸泡狀態(tài)下剪成 1cm2大小的碎片。注意：如果樣品可分成多組平行處理，得到線粒體粗提物后再匯集， 否則線粒體產(chǎn)率將急劇降低。
2.將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿器中，中速勻漿 3 次，每次
15 秒，每次之間間隔 10 秒以便讓碎片沉淀下來到刀片處。也可使用研磨法。具
體操作是將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到預冷的研缽中，研磨 3-4 分鐘。注意：植物組織勻漿后釋放的物質(zhì)會使勻漿液酸化，降低 pH，而線粒體對 pH 變化非常敏感，因此建議勻漿后用 pH 試紙檢測勻漿液的 pH，如果低于 7.0，必須用自備的 5 M KOH 將 pH 調(diào)到 7.0 以上才進入下一步。
3.用帶柄尼龍篩過濾勻漿液，穿透液可通過預冷的漏斗收集到預冷的 50 mL 的塑料離心管中。帶柄尼龍篩可以洗干凈后可以反復使用。
4.在低速固定角度冷凍離心機上 4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，沉淀為未破碎的細胞、破碎細胞的碎片、細胞核和淀粉顆粒，上清含線粒體。小心轉(zhuǎn)移上清到新的預冷的 50mL 塑料離心管中。
5.將裝上清的離心管在水平冷凍離心機上 4℃ 12,000 g 離心 20 分鐘，棄上清液， 所得棕綠色沉淀即為純化的線粒體粗提物。有時沉淀底部還有白色的淀粉沉淀， 屬于正�，F(xiàn)象。
6.加入 10 mL 預冷的洗滌液（需先加 0.1% BSA，下同）中，用軟毛筆輕柔重懸線粒體沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重懸之)。不能劇烈震蕩，否則線粒體容易破裂。
7.將線粒體重懸液轉(zhuǎn)移到新的 50mL 離心管中，再加入 30mL 預冷的洗滌液（終體積為 40 mL）中，4℃ 1000 g 離心 5 分鐘。線粒體將在上清中。
8.將上清轉(zhuǎn)移到新的預冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。小心棄上清。到此步時，線粒體回收率一般在 15-30%。
9.在沉淀中加入 2 mL 預冷的洗滌液。用軟毛筆輕柔重懸，得到線粒體粗提液。如果有平行提取，可將最多 4 管線粒體沉淀重懸在 2 mL 洗滌液中。線粒體粗提液中線粒體的回收率一般在 45-75%。
10.所得線粒體粗提液含其他細胞器（如類囊體膜, 質(zhì)體, 過氧化物酶體， 乙醛酸循環(huán)體,或細菌）污染，但可直接用于 PCR 級線粒體 DNA 和 RNA 的提取、呼吸鏈功能測定、蛋白濃度測定和線粒體精提。如果需要長期保存，則可以在線粒體重懸液中加入 1/20 體積的自備 DMSO，混勻后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的線粒體酶活性和膜完整性在幾年內(nèi)都不會發(fā)生變化。
三：細胞核 DNA 的去除（純化測序級的線粒體 DNA 才需要進行此操作。本產(chǎn)品不
提供相關試劑，實驗步驟僅供參考）
11.預留 50uL 線粒體粗提液做對照，在約 2 mL 剩余的線粒體粗提液中加入 40 uL 25mM 的 MgCl2，再加入 200ug DNase 干粉或溶液（總量為 200ug 即可），混勻后冰上放置 60 分鐘降解 DNA。取少量樣品（如 50uL）在 PCR 儀器中加熱到 95℃變性 10 分鐘滅活 DNase，再取其中的 10uL 和 10uL 預留的樣品一起進行細胞核基因?qū)Ｒ恍?PCR，如果 DNase 處理的樣品沒有擴增，而預留樣品有擴增，則表明 DNA 去除比較干凈（達到 PCR 檢測的極限），則進入下一步。如果未去除干凈，則繼續(xù)在冰上放置，直到 PCR 檢測不到細胞核 DNA。
12.加入 0.32 mL 預冷的自備 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 預冷的洗滌液。
13.4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的預冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000g 離心 20 分鐘，沉淀為去除細胞核 DNA 的線粒體。重懸在 2mL 洗滌液中。四：線粒體精提操作方案（需要 40000g 的超速冷凍離心機）
14.在 50 mL 預冷的塑料離心管中先后加入 35 mL 預冷的密度梯度離心介質(zhì)（配制方法見第三步，用前需先加 0.1% BSA）。
15.將 2 mL 線粒體粗提物重懸液鋪在密度梯度離心介質(zhì)上。
16.在超速水平離心機上 4℃ 40,000 g 離心 45 分鐘，最上層為黃色或橙色的質(zhì)體帶（如果材料是綠色植物，此帶將是綠色），其下的白色不透明的帶即為線粒體，管底沉淀為過氧化物酶體。其示意圖如下：
17.用廣口吸管（可將 1 mL 藍搶頭中間剪斷后使用）收集線粒體帶，注意避開其上的質(zhì)體帶過氧化物酶體沉淀，估計所取含線粒體溶液的體積。
18.在 15-20 分鐘的時間內(nèi)緩慢加入至少 4 倍體積的預冷的洗滌液。
19.轉(zhuǎn)入 50 mL 塑料管離心管中，在冷凍離心機上 4℃ 15,000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。
20.將線粒體沉淀用軟毛筆小心重懸在至少 4 倍體積的預冷的洗滌液中，在冷凍離心機上 4℃ 15,000 g 離心 20 分鐘，棄上清，沉淀即為洗滌后的線粒體精提物。到此步時，線粒體回收率一般在 5-15%。
21.將精提的線粒體重懸在 1mL 預冷的洗滌液中。重懸的線粒體可以立即使用，在冰上最多可放置 5-6 小時。如果需要長期保存，則可以在線粒體重懸液中加入1/20 體積的 DMSO，混勻后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的線粒體酶活性和膜完整性在幾年內(nèi)都不會發(fā)生變化。
五：線粒體后續(xù)處理（本產(chǎn)品不提供相關試劑，實驗步驟僅供參考）
22.DNA 提�。弘x心得線粒體沉淀，再按常規(guī)的 SDS-蛋白酶 K 酶解，酚氯仿抽提， 乙醇-鹽沉淀的方法制備線粒體 DNA。也可以用細菌 DNA 提取的試劑盒制備DNA。
23.RNA 提取：離心得線粒體沉淀，再按常規(guī)的 Trizol 方法制備線粒體 RNA。
24.總蛋白提�。喊醇毦偟鞍滋崛》椒ā�
25.線粒體內(nèi)膜，外膜、基質(zhì)純化：請自備方法。
26.其他功能檢測：請自備方法。
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