線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1) (Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential) ∆Ψm的理想熒光探針�？梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。
線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。JC-1檢測(cè)線粒體膜電位的效果參考圖1。
圖1. 本試劑盒檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞(大鼠腎小管上皮細(xì)胞)線粒體膜電位的效果圖。正常的NRK-52E細(xì)胞線粒體中JC-1以聚合物形式存在，呈明亮的紅色熒光，細(xì)胞中的綠色熒光非常弱；使用CCCP處理使線粒體膜電位下降后，JC-1便不能以聚合物形式存在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)線粒體內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度顯著降低，而細(xì)胞漿中的綠色熒光顯著增強(qiáng)。
JC-1單體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為514nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長(zhǎng)為585nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。JC-1單體和聚合物的激發(fā)光和發(fā)射光光譜參考圖2。
圖2.JC-1單體和聚合物的激發(fā)光和發(fā)射光光譜。本試劑盒提供了CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。
對(duì)于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè)100個(gè)樣品；對(duì)于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè)200個(gè)樣品。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。JC-1(200X)需避光保存，并盡量避免反復(fù)凍融。超純水和JC-1染色緩沖液(5X)也可4℃保存。
注意事項(xiàng)：
JC-1(200X)在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
必須先把JC-1(200X)用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-1染色緩沖液(5X)。不可先配制JC-1染色緩沖液(1X)再加入JC-1(200X)，這樣JC-1會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè)。
裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌時(shí)，使JC-1染色緩沖液(1X)保持4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。
JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。
請(qǐng)勿把JC-1染色緩沖液(5X)全部配制成JC-1染色緩沖液(1X)，本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用JC-1染色緩沖液(5X)。
如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液(5X)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。
CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，對(duì)人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1.JC-1染色工作液的配制：
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml，其它培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類(lèi)推；對(duì)于細(xì)胞懸液每50-100萬(wàn)細(xì)胞需0.5ml JC-1染色工作液。取適量JC-1(200X)，按照每50µl JC-1(200X)加入8ml超純水的比例稀釋JC-1。劇烈Vortex充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2ml JC-1染色緩沖液(5X)，混勻后即為JC-1染色工作液。
2.陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置：
把試劑盒中提供的CCCP(10mM)推薦按照1:1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10µM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常10µM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會(huì)完全喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。
3.對(duì)于懸浮細(xì)胞：
a.取10-60萬(wàn)細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
b.加入0.5ml JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
c.在孵育期間，按照每1ml JC-1染色緩沖液(5X)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X)，并放置于冰浴。
d.37℃孵育結(jié)束后，600g 4℃離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。
e.用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次：加入1ml JC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1ml JC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3-4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。
f.再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。
4.對(duì)于貼壁細(xì)胞：
注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。
a.對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
b.加入1ml JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
c.在孵育期間，按照每1ml JC-1染色緩沖液(5X)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X)，并放置于冰浴。
d.37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次。
e.加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
f.熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5.對(duì)于純化的線粒體：
a.把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液(1X)稀釋5倍。
b.0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10-100µg純化的線粒體。
c.用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描(time scan)，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為485nm時(shí)，可以在475-520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。另外，也可以參考下面步驟6中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè)。
d.用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。
6.熒光觀測(cè)和結(jié)果分析：
檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。​