Mito-Tracker Red CMXRos (線粒體紅色熒光探針,可固定通透)，也稱MitoTracker Red CMXRos，是一種具有細(xì)胞通透性的X-rosamine衍生物(Chloromethyl-X-rosamine，簡稱CMXRos)，能夠特異性地標(biāo)記細(xì)胞中具有生物活性的線粒體，檢測線粒體膜電位。本產(chǎn)品為高純度探針，兼容后續(xù)的細(xì)胞固定和通透，但染色后再固定和通透，熒光強(qiáng)度會有一定程度的下降。

本產(chǎn)品是一種氧化型的紅色熒光染料，只需簡單地和細(xì)胞孵育，即可通過被動運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜，并借助本探針含有的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基(mildly thiol-reactive chloromethyl)官能團(tuán)特異性地標(biāo)記有生物活性的線粒體。本探針含有的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基，可以和線粒體內(nèi)蛋白的巰基反應(yīng)并共價連接，因此后續(xù)實驗使用多聚甲醛或甲醛等醛類固定劑，以及細(xì)胞通透的去垢劑Triton X-100等處理時，線粒體的熒光標(biāo)記不會消失，但可能會有一定程度的下降(約下降2-10倍)。由于本熒光探針的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與常見的綠色熒光探針重疊較少，因此非常適合用于熒光雙標(biāo)實驗。

Mito-Tracker Red CMXRos分子式為C32H32Cl2N2O，分子量為531.5，CAS number為167095-09-2，Mito-Tracker Red CMXRos呈紅色熒光，最大激發(fā)波長為579nm，最大發(fā)射波長為599nm。Mito-Tracker Red CMXRos的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以及結(jié)構(gòu)式參考圖1。

圖1.Mito-Tracker Red CMXRos的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(A)以及結(jié)構(gòu)式(B)。

Mito-Tracker Red CMXRos可以用作線粒體特異性的熒光探針。和Rhodamine 123或JC-1相似，Mito-Tracker Red CMXRos對于線粒體的染色依賴于線粒體膜電位，因此該探針只能對活的細(xì)胞或組織進(jìn)行染色，不能對固定或通透后的細(xì)胞或組織進(jìn)行染色。使用Mito-Tracker Red CMXRos染色活細(xì)胞線粒體效果參考圖2。

圖2.Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透)染色NRK-52E細(xì)胞(大鼠腎小管上皮細(xì)胞)線粒體的效果。圖A為明場下大鼠腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)圖；藍(lán)色熒光為Hoechst 33342染色(C1027/C1028/C1029 Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100X))大鼠腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核(圖B)，紅色熒光為Mito-Tracker Red CMXRos染色大鼠腎小管上皮細(xì)胞的線粒體(圖C)，圖D為Hoechst 33342和Mito-Tracker Red CMXRos雙染的大鼠腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核與線粒體。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

由于Mito-Tracker Red CMXRos在線粒體內(nèi)的聚集依賴于線粒體的膜電位，因此本產(chǎn)品也可以作為線粒體膜電位的指示探針，通過檢測線粒體膜電位的變化來檢測細(xì)胞凋亡。

按最終工作濃度為50-200nM計算，本產(chǎn)品每50µg可以配制約500-2000ml Mito-Tracker Red CMXRos工作液。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，一年有效。

注意事項：

Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透)可以用于活細(xì)胞的線粒體熒光染色，不適合用于固定后細(xì)胞或者組織的染色；但在用本產(chǎn)品標(biāo)記線粒體后，后續(xù)可以進(jìn)行固定和通透，并用其它探針進(jìn)行染色或進(jìn)行免疫熒光染色，但染色后再固定和通透，熒光強(qiáng)度會有一定的下降。而且不同的細(xì)胞，固定和通透的影響會有所區(qū)別，建議對固定和通透試劑、條件進(jìn)行一定的測試。

本產(chǎn)品僅包含非常微量的粉末，使用前請先離心數(shù)秒鐘，使微量粉末充分沉降到管底。

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

使用本產(chǎn)品可以在常見的多孔板或培養(yǎng)皿中進(jìn)行熒光染色，也可以在蓋玻片或載玻片上進(jìn)行熒光染色。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Mito-Tracker Red CMXRos儲存液的配制：
取一管50μg Mito-Tracker Red CMXRos粉末加入470μl的無水DMSO (anhydrous dimethylsulfoxide)，充分溶解后，得到濃度為200μM的Mito-Tracker Red CMXRos儲存液。也可以根據(jù)需要配制成其它濃度的儲存液，如1mM。適當(dāng)分裝后避光保存于-20℃或更低溫度。
2.Mito-Tracker Red CMXRos工作液的配制：
a.取少量200μM Mito-Tracker Red CMXRos儲存液按照1:1000-1:10,000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為20nM-200nM。例如取1µl 200μM的Mito-Tracker Red CMXRos儲存液加入到1ml細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，混勻后即為200nM的Mito-Tracker Red CMXRos工作液。如果染色的細(xì)胞后續(xù)需要進(jìn)行固定或通透等步驟，建議工作濃度為50nM-200nM。Hanks' Balanced Salt Solution (with Ca2+ & Mg2+) (C0219)可以向雅吉訂購。
b.Mito-Tracker Red CMXRos工作液使用前需37℃預(yù)溫育。
注：Mito-Tracker Red CMXRos工作液的濃度可以根據(jù)實際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。為降低非特異性熒光染色和線粒體毒性，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Mito-Tracker Red CMXRos。
3.貼壁細(xì)胞的線粒體染色：
a.當(dāng)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至一定密度時，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟2中配制好的Mito-Tracker Red CMXRos工作液，37℃孵育15-30分鐘。注：最佳孵育時間需根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。
b.去除Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。
c.用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行觀察或檢測。此時可觀察到線粒體呈明亮的強(qiáng)熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高M(jìn)ito-Tracker Red CMXRos工作液濃度或在推薦的時間范圍內(nèi)適當(dāng)延長染色時間。
注：標(biāo)記的Mito-Tracker Red CMXRos易淬滅，請注意盡快進(jìn)行拍照等熒光檢測。也可以通過降低熒光顯微鏡的激發(fā)光強(qiáng)度(即汞燈或LED光源)或適當(dāng)降低Mito-Tracker Red CMXRos工作液濃度以延緩淬滅。
4.懸浮細(xì)胞的線粒體染色：
a.1000×g離心5分鐘，棄上清，用37℃預(yù)熱的Mito-Tracker Red CMXRos工作液輕輕重懸細(xì)胞，37℃孵育15-30分鐘。注：最佳孵育時間需根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。
b.孵育結(jié)束后，1000g離心5分鐘，棄上清，加入37℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
c.用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行觀察、分析或檢測。
注：如果需要在載玻片或蓋玻片上固定懸浮細(xì)胞，可先用雅吉的Poly-D-lysine/多聚賴氨酸(ST508)處理載玻片或蓋玻片。
5.染色后的細(xì)胞固定或細(xì)胞通透(選做)：
用本試劑染色線粒體后，可進(jìn)行固定和通透，并用其它探針再進(jìn)行染色。
a.細(xì)胞固定：在染色后，用37℃溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液或HBSS洗滌細(xì)胞，小心吸除洗滌用的培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定液(例如P0099)或含3.7%新鮮甲醛的完全培養(yǎng)液，室溫固定15-30分鐘。固定完成后用HBSS洗滌2-3次。
注：采用37℃預(yù)熱的固定液并在37℃固定約15min，可更好地維持細(xì)胞形態(tài)。對于內(nèi)皮細(xì)胞，在本染料染色之后再用含3.7%甲醛的完全培養(yǎng)液于37℃孵育15分鐘有良好的固定效果。
b.細(xì)胞通透：將固定后的細(xì)胞加入含約0.2% Triton X-100的PBS或雅吉生產(chǎn)的免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色強(qiáng)力通透液(P0095)，室溫孵育10-15分鐘。然后用PBS洗滌。使用本探針染色活細(xì)胞后，再固定和通透的細(xì)胞內(nèi)熒光效果參考圖3。
注1：對于內(nèi)皮細(xì)胞，在本染料染色之后再用含約0.2% Triton X-100的PBS室溫孵育10分鐘有良好的通透效果。
注2：也可用丙酮冰浴通透5分鐘，然后用PBS洗滌。即使后續(xù)無需抗體標(biāo)記，丙酮通透處理對降低背景信號也會有一定的幫助。
注3：染色后再固定和通透，熒光強(qiáng)度會有一定的下降，而且不同的細(xì)胞，固定和通透的影響會有所區(qū)別，建議對固定和通透試劑的濃度等進(jìn)行一定的摸索。

圖3.Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透)染色NRK-52E細(xì)胞后再經(jīng)固定和通透的細(xì)胞熒光染色效果。正常NRK-52E細(xì)胞Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透) 染色后線粒體內(nèi)呈清晰明亮的紅色熒光(圖A)；染色后經(jīng)4%多聚甲醛固定液(P0099)室溫固定15分后細(xì)胞內(nèi)紅色熒光略有下降，熒光出現(xiàn)一定程度的彌散(圖B)；固定后經(jīng)免疫染色強(qiáng)力通透液(P0095)通透后細(xì)胞內(nèi)紅色熒光進(jìn)一步下降(約下降2-10倍)，細(xì)胞內(nèi)線粒體呈較弱的紅色熒光，但線粒體染色相對比較清晰(圖C)。注：由于通透后線粒體熒光有一定程度的下降，為了方面觀察，圖C延長了拍攝時的曝光時間。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

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