微管綠色熒光染色試劑盒(活性染色用)，Tubulin-Tracker Green Staining Kit for Living Cells，是一種使用了便捷靈敏的熒光探針Oregon Green 488 Taxol bis-acetate的活細(xì)胞微管綠色熒光染色試劑盒。本試劑盒除了熒光探針還提供了促溶劑、染色增強(qiáng)劑和稀釋液，使熒光染色檢測非常便捷。

Tubulin-Tracker Green探針是一種不帶電荷的無熒光化合物，可輕松穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其親脂性基團(tuán)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶切除，就會變成帶電荷的熒光形式，可以產(chǎn)生綠色熒光。

Tubulin-Tracker Green在活細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散快、靈敏度高、能夠?qū)��?xì)胞微管均勻染色，可使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和檢測。

Taxol, 即paclitaxel，中文名紫杉醇，是一類能夠結(jié)合于微管的細(xì)胞骨架藥物，具有一定的細(xì)胞毒性，可以抑制細(xì)胞的有絲分裂，該作用與其結(jié)合細(xì)胞內(nèi)微管蛋白有關(guān)。Taxol可與聚合微管蛋白(polymerized tubulin)結(jié)合，結(jié)合后可促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定已聚合的微管，并將細(xì)胞周期阻滯于G2期和M期。所以需注意使用Tubulin-Tracker Green探針會抑制有絲分裂的進(jìn)行，并可能影響依賴于聚合微管蛋白的其它功能。

本試劑盒中的Tubulin-Tracker Green是Oregon Green® 488 Taxol (CAS號301844-13-3)的一種雙乙酸酯修飾形式，更易進(jìn)入細(xì)胞，熒光標(biāo)記更均一，特異性也更好。

Tubulin-Tracker Green分子式為C75H69F2N2O23，分子量約為1404，最大激發(fā)光波長為496nm，最大發(fā)射光波長為526nm。Tubulin-Tracker Green的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和光譜圖參考圖1。

圖1. Tubulin-Tracker Green的化學(xué)結(jié)構(gòu)式(圖A)及激發(fā)、發(fā)射光譜圖(圖B)。

Tubulin-Tracker Green只適用于對活細(xì)胞進(jìn)行微管的熒光標(biāo)記，不能對死細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。使用本產(chǎn)品標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)微管的效果參考圖2。

圖2. Tubulin-Tracker Green (微管綠色熒光探針)對于NRK-52E細(xì)胞(大鼠腎小管上皮細(xì)胞)的染色效果。Tubulin-Tracker Green染色的NRK-52E細(xì)胞其微管呈現(xiàn)綠色熒光(圖B)，Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)染色的NRK-52E細(xì)胞其線粒體呈現(xiàn)紅色熒光(圖C)，綠色熒光、紅色熒光及細(xì)胞核藍(lán)色熒光的疊加(merge)效果見圖D。其中細(xì)胞核使用Hoechst 33342 (C1027)染色。實(shí)際檢測效果會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本產(chǎn)品中提供的促溶劑可以促進(jìn)Tubulin-Tracker Green探針的溶解并改善染色效果；提供的染色增強(qiáng)劑(100X)是定位于活細(xì)胞膜上的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑，可降低去酯化的Tubulin-Tracker Green探針通過主動運(yùn)輸分泌到胞外；提供的Tubulin-Tracker Green稀釋液使活細(xì)胞的微管熒光染色和洗滌更加便捷。

對于96孔板或6孔板，按照1:1000配制Tubulin-Tracker Green染色工作液，且每孔使用100μl或1ml Tubulin-Tracker Green染色工作液，本試劑盒分別可以進(jìn)行200次或20次檢測。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，至少半年有效，-80℃保存，至少一年有效。促溶劑和Tubulin-Tracker Green稀釋液可以4℃保存。Tubulin-Tracker Green (1000X)需避光保存。

注意事項(xiàng)：

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

細(xì)胞在含染色增強(qiáng)劑(1X)的溶液中孵育的時間不能超過2小時。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Tubulin-Tracker Green (500X)中間貯存液的準(zhǔn)備：
融解并取出適當(dāng)體積的Tubulin-Tracker Green (1000X)，加入等體積的促溶劑，即為Tubulin-Tracker Green (500X)中間貯存液。Tubulin-Tracker Green (500X)中間貯存液密封避光保存于-20℃兩周內(nèi)有效。
2.Tubulin-Tracker Green染色工作液的配制：對于6、12、24、96孔板，每孔所需的Tubulin-Tracker Green染色工作液的用量分別為1~2ml、0.5~1ml、200~500μl和100μl。根據(jù)樣品數(shù)量，計算所需Tubulin-Tracker Green染色工作液的體積。以12孔板每孔1ml染色工作液的體系為例，參考下表配制Tubulin-Tracker Green染色工作液。

注1：Tubulin-Tracker Green染色工作液使用前需37℃預(yù)溫育。
注2：Tubulin-Tracker Green染色工作液中的Tubulin-Tracker Green的最終濃度需根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。Tubulin-Tracker Green的推薦工作濃度為1X，可以在0.5X-2X范圍內(nèi)摸索最佳工作濃度。為降低背景，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Tubulin-Tracker Green。
注3：本試劑盒中提供的Tubulin-Tracker Green稀釋液在一段時間內(nèi)可以維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好，也可以用其它合適的溶液，如無血清培養(yǎng)液代替。
3.活細(xì)胞微管的熒光標(biāo)記：
a.去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用適量的溶液如HBSS (C0218/C0219)或PBS (C0221A)洗滌生長在孔板、培養(yǎng)皿或爬片上的細(xì)胞。注：對于懸浮細(xì)胞的染色可以參考貼壁細(xì)胞的染色方法進(jìn)行。
b.去除洗滌液，加入步驟2配制好的并37℃預(yù)溫育的Tubulin-Tracker Green染色工作液，與細(xì)胞37℃共孵育30-120分鐘，不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同。以30分鐘作為初始孵育時間，根據(jù)所用細(xì)胞對孵育時間進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化以得到最佳效果。
c.去除Tubulin-Tracker Green染色工作液，用含染色增強(qiáng)劑 (1X)的Tubulin-Tracker Green稀釋液洗滌細(xì)胞2-3次。
d.用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察(Tubulin-Tracker Green為綠色熒光，Ex/Em = 496/526nm，設(shè)置與FITC或GFP相同)，此時可觀察到微管呈清晰的綠色熒光染色。注：染色完畢后應(yīng)立即觀察，放置時間過長會導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱。​