谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒(DTNB法)(Glutathione Reductase Assay Kit with DTNB)是一種簡單易行的通過比色法來檢測細胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性的試劑盒。谷胱甘肽還原酶在許多組織中都有分布，可以維持細胞內(nèi)充足的還原型谷胱甘肽(GSH)水平。GSH可以清除自由基和一些有機過氧化物，或作為谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase)的底物來清除一些過氧化物。

谷胱甘肽還原酶可以還原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成還原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG，并可以通過測定A412來檢測TNB的生成量。適當(dāng)設(shè)置應(yīng)體系，前后兩個反應(yīng)合并起來后，GSSG/GSH過量而GR相對不足時，該反應(yīng)體系中谷胱甘肽還原酶就成為整個反應(yīng)體系的限速因素，此時黃色的TNB生成量和谷胱甘肽還原酶的活性呈線性正相關(guān)。從而通過測定A412就可以計算出谷胱甘肽還原酶的活性水平。本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下：

兩個反應(yīng)相合并：
本試劑盒檢測肝臟樣品的檢測效果如圖1所示。圖中可見，對于肝臟樣品可以檢測到比較強的谷胱甘肽還原酶的活性并且有很好的劑量效應(yīng)。
圖1. 谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒(DTNB法)用于肝臟裂解樣品的實測效果圖。包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。NADPH溶解后宜分裝并-70℃保存，4℃可以保存一天，-20℃保存一周后NADPH會降解10%以上。GSSG和DTNB在配制成溶液后，適當(dāng)分裝后-20℃保存。
注意事項：
本試劑盒檢測時涉及氧化還原反應(yīng)，因此所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定。如果在樣品中的還原劑無法避免，例如DTT、巰基乙醇等，則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。另外，硫酸鈉、硫酸銨和鐵氰化物都會干擾本試劑盒的測定。請盡量避免。
樣品可以立即測定，也可以-70℃凍存待以后測定。
一定要嚴格控制反應(yīng)時的溫度為25℃，否則會引起較多誤差。
NADPH不太穩(wěn)定，要嚴格按照后續(xù)說明操作，謹防失活。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 

使用說明：
1.樣品的準備：
a.細胞樣品的準備。對于貼壁細胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，應(yīng)避免使用胰酶消化細胞，可以用PBS、HBSS或生理鹽水洗滌一遍。對于懸浮細胞，可以離心收集細胞，并用PBS、HBSS或生理鹽水洗滌一遍。后續(xù)可以用Western及IP細胞裂解液(P0013)參考相應(yīng)的說明裂解細胞樣品。按照每100萬細胞直接加入100-200微升裂解液的比例進行裂解。對于貼壁細胞，可以使用細胞鏟或細胞刮(FLFT021/FSCP023/FSCP029)輔助收集細胞樣品。如果出現(xiàn)裂解效果不佳的情況，可以把處在裂解液中的細胞樣品用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。隨后4℃，12,000×g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
b.組織樣品的準備。動物用含有0.16mg/ml heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照約每20mg組織加入200微升Western及IP細胞裂解液(P0013)或其它適當(dāng)?shù)膭驖{液的比例，用TissueMaster™手持式組織研磨儀(E6600)或玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12,000×g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
c.紅細胞裂解液的準備。用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500微升全血4℃ 2500×g離心5分鐘。棄上清，用冰冷的約紅細胞沉淀10倍體積的Western及IP細胞裂解液(P0013)或其它適當(dāng)?shù)膭驖{液重懸沉淀，再同前離心，棄上清。加入約紅細胞沉淀4倍體積的冰冷的Milli-Q級純水裂解紅細胞。12,000×g離心5分鐘，取上清。
d.上述各種樣品可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定蛋白濃度。通�？梢韵热『�1-100微克蛋白的樣品用于谷胱甘肽還原酶的檢測。注：對于GR活力較高的組織樣品，含1-10微克蛋白的樣品可能就能滿足檢測需求，而對于GR活力較低的樣品，可能需要10-100微克的蛋白量。如果發(fā)現(xiàn)樣品中谷胱甘肽還原酶的活力過高，可以用谷胱甘肽還原酶檢測緩沖液進行稀釋。如果樣品中谷胱甘肽還原酶的活力過低，則需適當(dāng)加大蛋白用量。準備好的樣品如果當(dāng)日測定，可以在冰浴或4℃臨時保存；如果不能當(dāng)日檢測，可以-70℃凍存。
2.試劑盒的準備工作：
a.配制6mM NADPH溶液的配制。在本試劑盒提供的5mg NADPH中加入1ml Milli-Q級純水或重蒸水，溶解并混勻，即為6mM NADPH溶液。除立即待用部分外，其余的NADPH溶液需適當(dāng)分裝后盡快-70℃保存。
b.GSSG溶液的配制。在本試劑盒提供的14.2mg GSSG中加入10ml Milli-Q級純水，溶解并混勻。除立即待用部分外，其余的GSSG溶液需適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c.DTNB溶液的配制。在本試劑盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本試劑盒提供的DMSO，溶解并混勻。除立即待用部分外，其余的DTNB溶液需適當(dāng)分裝后-20℃保存。
d.所有試劑在使用前均須在水浴中或PCR儀等設(shè)備上溫育到25℃。
3.樣品測定：
a.參考下表(表1)，使用96孔板，依次加入各溶液，混勻。

b.加入6.6微升DTNB溶液，混勻。
c.立即使用適當(dāng)?shù)拿笜藘x或微量紫外分光光度計測定A412，此時記錄為0分鐘讀值，即A412 (Time 0)。如果儀器可以設(shè)置溫度，把溫度設(shè)置在25℃，否則可以通過空調(diào)調(diào)節(jié)室溫到25℃，待預(yù)計儀器也達到25℃后再開始測定A412。
d.每隔2分鐘記錄A412值，即A412 (Time n)，至少連續(xù)記錄10分鐘，獲得5個點的數(shù)據(jù)。或者如果儀器具備相應(yīng)功能，可以讓儀器連續(xù)測定10分鐘或自動每隔2分鐘測定一次A412。如果樣品的吸光度比較低，可以延長孵育時間，樣品的吸光度在一定范圍內(nèi)會隨時間的延長接近于線性增加的，此時可以考慮每10分鐘測定一次吸光度。
4.樣品中谷胱甘肽還原酶酶活力的計算：
a.谷胱甘肽還原酶酶活力單位的定義：1個酶活力單位(1 unit)在25℃，pH7.5的條件下，在1分鐘內(nèi)可以還原化1微摩爾GSSG。1 U=1000 mU。
b.計算時每個樣品的A412/min都需要扣除相應(yīng)的樣品本底對照測定出來的A412/min。測定出來的ΔA412/min最好能控制在0.005-0.1范圍內(nèi)。如測定出來的ΔA412/min數(shù)值過大，則可以把樣品適當(dāng)稀釋或者減小樣品的用量，如ΔA412/min數(shù)值過小，處理樣品時需設(shè)法盡量濃縮樣品、并適當(dāng)加大樣品的用量。肝臟裂解樣品的實測效果參考圖1。
注：ΔA412 (blank)=A412 (blank, Time n)-A412 (blank, Time 0);
ΔA412 (sample)=A412 (sample, Time n)-A412 (sample, Time 0);
ΔA412=ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank);
ΔA412/min=ΔA412/n
c.對于谷胱甘肽還原酶：1mU/ml＝1nmol TNB/min/ml＝(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))
即相當(dāng)于：[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]= (ΔA412/min)/(εμM×L(cm))=[(ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank))/min]/ (εμM×L(cm))
[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]＝[檢測體系中消耗谷胱甘肽還原酶活力]×[稀釋倍數(shù)]/[樣品中的蛋白濃度] = [(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))]×[dil×(V(ml)/Vsample(ml))]/[樣品中的蛋白濃度]
注：[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]的單位為mU/ml，[樣品中的蛋白濃度]的單位為mg/ml，所以最終[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]的單位為：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；
εμM為摩爾消光系數(shù)：TNB在A412的摩爾消光系數(shù)為0.01415μM-1cm-1；
L(cm)為測吸光度時的路徑長度：200μl樣品在一般的96孔中的高度約為0.552cm，如果使用不同的反應(yīng)孔，請注意修改為溶液在該孔中的高度；
dil為樣品的稀釋倍數(shù)；
V(ml)為反應(yīng)體系，本反應(yīng)體系為0.2ml；
Vsample(ml)為反應(yīng)體系中樣品的體積，以毫升表示。
d.計算示例：樣品的蛋白濃度經(jīng)測定為5mg/ml，用樣品稀釋液稀釋10倍后，取10微升稀釋后的樣品參考表1進行測定。如果ΔA412/min(sample)＝0.048，ΔA412/min(blank)＝0.006，那么：
[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]= (0.048-0.006)/(0.01415×0.552) =5.38mU/ml
[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]= 5.38mU/ml×10×0.2/0.01/(5mg/ml)= 0.2152U/mg(蛋白)