細(xì)胞線粒體分離試劑盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是用于快速便捷地分離培養(yǎng)細(xì)胞線粒體的試劑盒。

本試劑盒在分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于研究細(xì)胞色素c等線粒體蛋白向胞漿的釋放。
使用本試劑盒分離獲得的線粒體純度較高，并且絕大部分分離獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能。因此本試劑盒分離得到的線粒體可以用于線粒體的生理功能等方面的研究。例如可以使用C2006 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)測定分離得到的線粒體的膜電位。
本試劑盒分離得到的線粒體也可以被試劑盒中的線粒體裂解液或其它適當(dāng)裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。
本試劑盒提供了線粒體制備過程中勻漿程度的重要判斷指標(biāo)，即臺盼藍(lán)染色，使分離得到的線粒體的質(zhì)量更加有保證。臺盼藍(lán)染色液為選用試劑，在實驗條件成熟后可以不必使用。
本試劑盒提供了蛋白酶抑制劑PMSF，使勻漿時蛋白酶的活性被適當(dāng)抑制，這樣在獲得線粒體的同時還可以獲得有時有用的去除了大量線粒體的蛋白，在進(jìn)行蛋白或酶活分析時可以作為對照。
如果每個樣品的細(xì)胞數(shù)量為2000-5000萬，本試劑盒可以處理50-100個樣品。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。其中臺盼藍(lán)染色液也可以4℃保存，PMSF(晶體)和PMSF(溶劑)在配制成100mM PMSF溶液前可以室溫保存。
注意事項：
試劑盒中的試劑對于不同的實驗?zāi)康牟槐厝�部使用�?br />如果不是用于制備線粒體蛋白樣品，線粒體分離試劑和線粒體裂解液中不必加入PMSF。
如果用于制備線粒體蛋白樣品，線粒體分離試劑和線粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線粒體分離試劑或線粒體裂解液加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。
通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取600g和11,000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用1000g和3500g。
使用本試劑盒中的線粒體儲存液稀釋或儲存的線粒體樣品應(yīng)及時使用，以免線粒體膜電位受影響。如果不能及時使用，建議在-80℃保存。凍存后的線粒體樣品不推薦用于膜電位的檢測，但可以用線粒體蛋白或核酸的相關(guān)檢測。
如果出現(xiàn)本試劑盒中線粒體儲存液不夠用的情況，可以單獨訂購線粒體儲存液(C3609)。
臺盼藍(lán)與PMSF對人體有毒，操作時請?zhí)貏e小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(P0006)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(P0006C)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)可以向訂購。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的各種溶液，融解后立即置于冰上并混勻。第一次使用時，把1.5ml PMSF(溶劑)加入到PMSF(晶體)中，溶解并混勻，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液-20℃保存。如果最終目的是制備線粒體蛋白樣品，根據(jù)樣品數(shù)量，取適量線粒體分離試劑備用，在線粒體分離試劑加入到細(xì)胞樣品中前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。同時，根據(jù)樣品數(shù)量取適量線粒體裂解液備用，在線粒體裂解液加入到線粒體樣品中前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
2. 收集細(xì)胞：
對于貼壁細(xì)胞：用PBS洗一遍，用胰酶細(xì)胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化細(xì)胞，100-200g，室溫離心5-10分鐘收集細(xì)胞。胰酶細(xì)胞消化液(C0201)可以向訂購。
對于懸浮細(xì)胞：直接離心收集細(xì)胞。
3. 洗滌細(xì)胞：用冰浴預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)，剩余細(xì)胞600g，4℃離心5分鐘沉淀細(xì)胞。棄上清。
4. 預(yù)處理：加入1-2.5ml線粒體分離試劑或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑至2000-5000萬細(xì)胞中，輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴放置10-15分鐘。
5. 勻漿：把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一適當(dāng)大小的玻璃勻漿器中，勻漿10-30下左右。
6. 勻漿效果的鑒定：不同細(xì)胞不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。通�？梢栽趧驖{10次后取約2微升細(xì)胞勻漿，加入30-50微升臺盼藍(lán)染色液，混勻后顯微鏡下觀察臺盼藍(lán)染色陽性(藍(lán)色)細(xì)胞的比例。如果陽性細(xì)胞比例不足50%，增加5次勻漿。隨后再同前取樣進(jìn)行臺盼藍(lán)染色鑒定。當(dāng)陽性比例超過50%時即可停止勻漿進(jìn)入下一步。請勿過度勻漿，過度勻漿會導(dǎo)致線粒體的機(jī)械損傷。同時記錄對于該細(xì)胞的勻漿次數(shù)，通常在后續(xù)實驗時不必再摸索勻漿次數(shù)。
7. 把細(xì)胞勻漿在600g，4℃離心10分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
8. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4℃離心10分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
9. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的細(xì)胞線粒體。
注：如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12,000g，4℃離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。該細(xì)胞漿蛋白可以使用BCA法或Bradford法測定蛋白濃度。
10. 線粒體的使用：
a. 如果用于完整線粒體的功能或酶活性研究，初始2000-5000萬細(xì)胞分離得到的線粒體樣品中可以加入150-200微升線粒體儲存液，重懸線粒體。
b. 如果用于線粒體的蛋白分析，初始2000-5000萬細(xì)胞分離得到的線粒體樣品中可以加入150-200微升臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體。裂解后的線粒體可以用于PAGE、Western、IP以及線粒體中的一些酶活性的測定等。裂解后的蛋白樣品可以使用BCA法或去垢劑兼容型Bradford法(P0006C)測定蛋白濃度。
c. 如果用于雙向電泳，請使用適當(dāng)?shù)挠糜陔p向電泳的裂解液處理線粒體。

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