生產(chǎn)的支原體PCR檢測試劑盒(Mycoplasma PCR Detection Kit)，是一種通過巢式PCR法(Nested PCR)檢測培養(yǎng)細胞等生物材料中是否存在支原體污染的檢測試劑盒。
支原體(Mycoplasma)是最小、最簡單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無細胞壁結(jié)構(gòu)，所以針對細胞壁的許多常見的抗生素，如青霉素或β-內(nèi)酰胺類抗生素對支原體無效；支原體大小介于細菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過0.22μm濾器，常規(guī)的過濾對支原體無效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細胞表面和細胞之間。支原體的這些特征使細胞培養(yǎng)過程中存在支原體污染的風險，細胞的支原體污染已經(jīng)成為一個世界性的普遍問題。
支原體污染可能會嚴重影響細胞的狀態(tài)，使細胞的基因表達、代謝特征發(fā)生變化，導(dǎo)致細胞生長減緩、分化和死亡異常，嚴重影響細胞功能。這些影響因素會嚴重影響實驗結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和一致性，因此支原體污染的檢測非常重要。
細胞培養(yǎng)過程中的細菌、酵母或霉菌污染在光學顯微鏡下可見，但支原體污染在光學顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進行檢測。檢測支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、發(fā)光法等特殊的生化檢測以及DNA熒光染色檢測等。上述檢測方法中，大多操作步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高、不能區(qū)分支原體種類、需要特殊儀器或所需時間較長。而PCR法操作相對比較簡單便捷，PCR擴增后通過電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據(jù)擴增片段的大小大致預(yù)測至少11種所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對PCR產(chǎn)物進行常規(guī)測序以確定具體的支原體種屬。
本支原體PCR檢測試劑盒是利用兩對引物通過巢式PCR法特異性擴增支原體基因組DNA片段，從而實現(xiàn)對支原體的高靈敏度特異性檢測的。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)(space region)在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區(qū)。這個間隔區(qū)的DNA序列及長度在支原體各個種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設(shè)計一對F1/R1引物，用于擴增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的第一輪PCR (1st PCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計一條R2引物進行巢式PCR的第二輪PCR (2nd PCR)。通過巢式PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。本產(chǎn)品的檢測原理請參考圖1。
圖1. 支原體PCR檢測試劑盒的檢測原理圖。
本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。
本試劑盒提供了陽性對照Control template，便于確定PCR檢測是否能正常工作，及樣品中是否存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。
如果發(fā)現(xiàn)有支原體污染，建議更換無污染的細胞進行培養(yǎng)。如果有必要預(yù)防或去除支原體，可以使用專用的支原體預(yù)防或去除試劑(C0288、C0290、C0292、C0293)。
如果用于20μl的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒共可以進行250次檢測。如果用于50μl的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒共可以進行100次檢測。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C0301S-1 | 1st PCR Primer Mix (50X) | 100μl |
| C0301S-2 | 2nd PCR Primer Mix (50X) | 100μl |
| C0301S-3 | Control template | 100μl |
| － | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
一般情況，1st PCR可以初步鑒定是否有支原體污染，但建議進行2nd PCR以進一步確認。
本試劑盒不能檢測出人肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 實驗前的準備工作：
a. 需要用戶自己準備的器材
(a) PCR擴增儀。
(b) 瓊脂糖凝膠電泳裝置。
(c) 微量離心機。
(d) 無菌PCR管、離心管、槍頭及移液槍。
b. 試劑和檢測樣品準備
(a)雙蒸水或超純水。
(b)2X PCR Master Mix (D7228)、Easy-Load™ PCR Master Mix (2X) (D7251/D7255/D7259)或者其它Taq酶及PCR所需的dNTP等。
(c)瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液、DNA分子量標準、電泳染料。
(d)樣品：用于檢測支原體污染的樣品是細胞接種后培養(yǎng)了3-6天的培養(yǎng)上清液，或者是培養(yǎng)液、血清；如果使用細胞懸液做樣品，則需要提取DNA后再進行PCR。加入量一般為反應(yīng)體系1/10的量或更少。
2. 1st PCR反應(yīng)：
a. 融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將2X PCR Master Mix，例如Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)置于冰浴上或冰盒內(nèi)。參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)：
| 試劑 | 最終濃度 | 體積 | 體積 |
| 雙蒸水或超純水 | - | 7.6-9.2μl | 19-23μl |
| 檢測樣品(DNA)或Control template | 0.2pg/μl -20ng/μl | 0.4-2μl | 1-5μ |
| 1st PCR Primer Mix (50X) | 1X | 0.4μl | 1μl |
| Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X) | 1X | 10μl | 25μl |
| 總體積 | - | 20μl | 50μl |
注：Control template的推薦用量為1μl。
b. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
STEP1 (起始變性): 94ºC 30sec
STEP2 (變性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30-35 cycles
STEP6 (最終延伸): 72ºC 5min
STEP7 (臨時保存): 4ºC forever
3. 2nd PCR反應(yīng)：：
a. 參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)：
| 試劑 | 最終濃度 | 體積 | 體積 |
| 雙蒸水或超純水 | - | 9.4μl | 23.5μl |
| 1st PCR產(chǎn)物 | 0.2pg/μl -20ng/μl | 0.2μl | 0.5μl |
| 2nd PCR Primer Mix (50X) | 1X | 0.4μl | 1μl |
| Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X) | 1X | 10μl | 25μl |
| 總體積 | - | 20μl | 50μl |
b. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
STEP1 (起始變性): 94ºC 30sec
STEP2 (變性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6 (最終延伸): 72ºC 5min
STEP7 (臨時保存): 4ºC forever
4. 擴增產(chǎn)物的電泳分析：
a. 反應(yīng)結(jié)束后，取1st PCR及2nd PCR的反應(yīng)產(chǎn)物各10μl，進行電泳確認擴增有無片段及片段大小。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖請參考圖2。如果實驗?zāi)康闹皇谴_定是否有支原體污染，1-2%的瓊脂糖凝膠電泳均可；如果需要確定片段大小并據(jù)此大致推測污染支原體的種類，優(yōu)先推薦使用2%的瓊脂糖凝膠電泳。
圖2. 使用本支原體PCR檢測試劑盒進行PCR檢測時擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳示意圖。1、2、3是1st PCR產(chǎn)物；1#、2#、3#是相應(yīng)的2nd PCR產(chǎn)物。各泳道的模板分別是：1和1#，Control template；2和2#，支原體污染的細胞上清；3和3#，超純水。M為DNA marker。
b. 以不同種屬的支原體為模板，1st PCR及2nd PCR的反應(yīng)產(chǎn)物的條帶大小不同，具體擴增片段大小可參考下表。
本試劑盒確定可以擴增的支原體種類及1st PCR和2nd PCR擴增產(chǎn)物長度參考表：
| 種屬 | GenBank編號 | 1st PCR (bp) | 2nd PCR (bp) |
| Mycoplasma arginini | JN935883 | 370 | 145 |
| Mycoplasma arthritidis | AY973560 | 408 | 157 |
| Mycoplasma capricolum | AY800346 | 415 | 221 |
| Mycoplasma fermentans | AY816338 | 492 | 195 |
| Mycoplasma hominis | AY738737 | 370 | 148 |
| Mycoplasma hyopneumoniae | JN935889 | 682 | 238 |
| Mycoplasma hyorhinis | AY973572 | 452 | 211 |
| Mycoplasma neurolyticum | AY796063 | 502 | 196 |
| Mycoplasma orale | AY737010 | 424 | 179 |
| Mycoplasma pulmonis | JN935865 | 477 | 190 |
| Mycoplasma salivarium | AY786574 | 403 | 151 |
| Ureaplasma urealyticum | AY741673 | 482 | 154 |
注：本試劑盒主要用于檢測是否有支原體污染，但也可以通過1st PCR和2nd PCR擴增產(chǎn)物長度大致預(yù)測所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對PCR產(chǎn)物進行常規(guī)測序以確定具體的支原體種屬。
5. 關(guān)于陽性對照反應(yīng)：
a. 一方面陽性對照Control template可以單獨使用，以確定PCR反應(yīng)體系是否能正常工作。另一方面，陽性對照Control template也可以添加到樣品中，以確定樣品中是否含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。Control template是人工合成的DNA片段，使用Control template時，1st PCR的反應(yīng)產(chǎn)物是810bp，2nd PCR的反應(yīng)產(chǎn)物是590bp。
b. 如果陽性對照Control template單獨使用時沒有獲得擴增片段，提示PCR檢測體系存在問題，需要考慮更換PCR反應(yīng)相關(guān)試劑。
c. 如果陽性對照Control template單獨使用時獲得了預(yù)期的擴增片段，而陽性對照Control template添加到樣品一起進行PCR擴增反應(yīng)時沒有獲得任何PCR擴增產(chǎn)物，提示PCR體系工作正常，但檢測樣品中存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。此時建議將檢測樣品進行DNA抽提，再用提取的DNA作為模板進行擴增。也可以嘗試將樣品用超純水或PBS適當稀釋后再進行測試，此時如果樣品中支原體的污染程度比較高，基本上不會影響檢測，但如果樣品中支原體的污染程度比較低，很可能會導(dǎo)致檢測靈敏度顯著下降。
d. 如果陽性對照Control template單獨使用時獲得了預(yù)期的擴增片段，而陽性對照Control template添加到樣品一起進行PCR擴增反應(yīng)時可能僅獲得支原體的PCR擴增產(chǎn)物或僅獲得陽性對照Control template的擴增產(chǎn)物，也可能同時獲得支原體和陽性對照Control template的擴增產(chǎn)物。其中一種模板量比較多時，通常更容易擴增獲得哪種模板的PCR擴增產(chǎn)物。其中一種模板特別多時，另外一種模板可能檢測不到明顯的擴增。
