活細胞Caspase-3活性與Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(Caspase-3 Activity and Apoptosis Detection Kit for Live Cell)是基于新型的具有細胞膜通透性的Caspase-3/7綠色熒光底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate聯(lián)合細胞凋亡紅色熒光探針Annexin V-mCherry來檢測培養(yǎng)細胞中Caspase-3活性和細胞凋亡的紅綠熒光雙染試劑盒，可用于實時監(jiān)測活細胞中Caspase-3活性和凋亡情況。本試劑盒適用于流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測系統(tǒng)進行檢測。

細胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細胞主動有序的死亡方式。當細胞遇到內、外環(huán)境因子刺激時，啟動基因調控的自殺保護措施，去除體內非必需細胞或即將發(fā)生特化的細胞。在這一過程中，細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細胞或鄰近細胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。細胞凋亡失調與多種疾病有關，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。

Caspase (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)的全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于蛋白質中，主要利用半胱氨酸(cysteine)側鏈選擇性地高效切割含有天冬氨酸(aspartate)的多肽底物，在介導細胞凋亡(apoptosis)過程中起重要作用，并參與細胞的炎癥、生長和分化等過程。Caspase-3也稱CPP32、Yama或apopain，屬于caspase家族的CED-3亞家族(CED-3 subfamily)，是哺乳動物細胞中研究最多的一個caspase。Caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶，可以直接特異性剪切許多caspase底物，包括PARP (poly ADP-ribose polymerase)、ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、proCaspase-6、7和9、gelsolin和fodrin等。這些由Caspase-3介導的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分。同時Caspase-3還參與細胞核凋亡過程，如染色質固縮(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。另外，Caspase-3對凋亡過程中的細胞起泡(cell blebbing)也起到了關鍵作用。

GreenNuc™ Caspase-3為耦合DNA綠色熒光染料的多肽DEVD，該底物中的DEVD是caspase 3/7的識別序列，并帶有大量負電荷。這些負電荷和DNA帶有的負電荷相互排斥，使底物中的DNA綠色熒光染料不能結合DNA，也就不能被激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光。最初沒有熒光的底物穿過細胞膜進入細胞質，在凋亡細胞中被Caspase-3/7識別并剪切，釋放出活化的DNA綠色熒光染料分子�；罨�的DNA綠色熒光染料分子遷移進入細胞核，與DNA結合后，形成GreenNuc™-DNA復合物，就可以被激發(fā)而產(chǎn)生明亮的綠色熒光。

在正�；罴毎�中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)位于細胞膜的近細胞質面。而在凋亡細胞中，PS從質膜的內部外翻到細胞表面即細胞膜外側，從而使PS暴露于細胞外部。在白細胞的凋亡過程中，白細胞表面的PS標記可以被巨噬細胞識別，從而最終被巨噬細胞吞噬。人血管抗凝血劑Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，分子量為35-36kDa，對PS具有高親和力。用帶有紅色熒光的mCherry標記的Annexin V (Annexin V-mCherry)染色細胞，就可以通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀等熒光檢測設備非常簡單而直接地檢測到PS的外翻這一細胞凋亡的重要特征。需要指出的是對于發(fā)生壞死(necrosis)的細胞，由于細胞膜的完整性被破壞，位于細胞膜內側的PS也會被Annexin V-mCherry染色。本試劑盒不區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞，如有需要，可參考C1062 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒。

本試劑盒檢測的是GreenNuc™-DNA復合物的綠色熒光和Annexin V-mCherry紅色熒光，GreenNuc™-DNA的最大激發(fā)光波長為500nm，最大發(fā)射光波長為530nm；Annexin V-mCherry的最大激發(fā)光波長為587nm，最大發(fā)射光波長為610nm。GreenNuc™-DNA復合物和Annexin V-mCherry的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。

圖1. GreenNuc™-DNA復合物(綠色)和Annexin V-mCherry(紅色)的激發(fā)光和發(fā)射光光譜。

本試劑盒中檢測試劑配制后直接加入細胞中，孵育15-30分鐘后即可直接用于熒光顯微鏡、流式細胞儀或熒光酶標儀檢測等檢測系統(tǒng)進行定性或定量檢測。正常細胞不會被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色，Caspase-3活性高的凋亡細胞的細胞核呈明亮的綠色熒光，凋亡細胞會被Annexin V-mCherry染成紅色熒光。使用本試劑盒檢測Caspase-3/7活性和細胞凋亡的效果參考圖2。

圖2. 活細胞Caspase-3活性與細胞凋亡檢測試劑盒檢測BGC-823細胞(人胃癌細胞) Caspase-3活性和細胞凋亡的效果。正常狀態(tài)的BGC-823細胞在明場下的形態(tài)見圖A；正常細胞不會被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色(圖B-D)。TS誘導3小時后的BGC-823細胞在明場下的形態(tài)見圖E；細胞內Caspase-3活性高的凋亡細胞核呈明亮的綠色熒光，凋亡細胞的細胞膜呈紅色熒光(圖F-H)。TS是由TNFα、SM-164組成的細胞凋亡誘導試劑(C0006S)。實際檢測效果會因實驗條件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。

本試劑盒檢測可以實時監(jiān)測細胞內Caspase-3/7活性。傳統(tǒng)的Caspase活性檢測試劑盒，通常需要裂解細胞或組織樣品后進行顯色或熒光檢測；通過Western檢測Caspase本身和剪切后蛋白的表達情況，也只能檢測Caspase的表達情況，從一定程度上反應酶活性；基于熒光標記的Caspase抑制劑的檢測技術(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以進入活細胞檢測Caspase活性，但其熒光探針本身就是不可逆的Caspase抑制劑，所以無法在活細胞中實時監(jiān)測Caspase的活力。而本試劑盒中提供的熒光底物GreenNuc™ Caspase-3對細胞活性沒有明顯的抑制作用，不影響Caspase的表達，不抑制細胞的凋亡過程，有助于實時監(jiān)測細胞凋亡。

本試劑盒功能強大。使用本試劑盒檢測Caspase-3/7的活性的同時，可以實時觀察細胞核在凋亡過程中的形態(tài)學變化，還能夠檢測細胞凋亡過程中PS外翻這一經(jīng)典事件。在眾多凋亡的細胞內，不同細胞可能處在不同階段并經(jīng)歷著凋亡過程中的不同事件，因而研究中很重要的一點就是能實時獨立地跟蹤這些事件，從而更好地了解事件之間的相互關系。本試劑盒可以通過熒光顯微鏡、流式細胞儀來研究這些不同事件的時間、空間關系。

本試劑盒小包裝C1077S和中包裝C1077M用于流式細胞儀分別可以進行20次和50次檢測；用于96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時分別可以檢測40次和100次，檢測體系體積為200μl時分別可以檢測20次和50次。實際檢測次數(shù)會因為檢測體系和使用的底物濃度而有所不同。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。Annexin V-mCherry和GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)避光保存。

注意事項：

避免微生物污染，如有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。

染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。

如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-mCherry，最終導致染色失敗。

GreenNuc™ Caspase-3 Substrate不是很穩(wěn)定，應盡量避免反復凍融(一般不要超過三次)。

用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry或GreenNuc™信號過強，并且通過調整相關設置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS (C0221A)將Annexin V-mCherry或GreenNuc™稀釋3-10倍后再進行檢測。

熒光物質均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.對于懸浮細胞：
a.在凋亡誘導結束后，1000×g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注：PBS重懸不能省略，該步驟起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-mCherry的結合。
b.取5-10萬重懸的細胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞。
c.加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，輕輕混勻。
d.室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，孵育完畢后置于冰浴中。注：可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以適當重懸細胞2-3次以改善標記效果。
e.隨即進行流式細胞儀檢測，GreenNuc™-DNA為綠色熒光(Ex/Em=500/530nm)，Annexin V-mCherry為紅色熒光(Ex/Em=587/610nm)。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry單獨染色時出現(xiàn)了過多的GreenNuc™ Caspase-3假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進行檢測。
2.對于貼壁細胞：
a.在凋亡誘導結束后，把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞脫落為止，吸除胰酶細胞消化液，避免胰酶的過度消化。
b.加入步驟2a中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉移到離心管內，1000×g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注：加入步驟2a中的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-mCherry導致染色失敗。
c.取5-10萬重懸的細胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞。
d.加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，孵育完畢后置于冰浴中。注：可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以適當重懸細胞2-3次以改善標記效果。
f.隨即進行流式細胞儀檢測，GreenNuc™-DNA為綠色熒光(Ex/Em=500/530nm)，Annexin V-mCherry為紅色熒光(Ex/Em=587/610nm)。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry單獨染色時出現(xiàn)了過多的GreenNuc™ Caspase-3假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進行檢測。
3.對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a.選做：在凋亡誘導結束后，對于培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板的細胞進行離心，1000×g離心5分鐘。
b.吸除細胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。
c.加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer。
d.加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘�？梢允褂娩X箔進行避光。
f.隨即在熒光顯微鏡下觀察，GreenNuc™-DNA為綠色熒光(Ex/Em=500/530nm)，Annexin V-mCherry為紅色熒光(Ex/Em=587/610nm)。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。​