植物基因型快速鑒定試劑盒，即BeyoPlant™ Rapid Plant Genotyping Assay Kit植物樣品直接PCR預(yù)混液(2X)，提供了一種使用特別便捷的all-in-one的2倍濃度的檢測試劑，加入一小塊植物葉片等柔嫩的組織和適量的引物和水，就可以直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后續(xù)直接電泳觀察結(jié)果就可以判斷植物的基因型了。本產(chǎn)品不僅可以用于植物的基因型鑒定，也可以用于其它適當(dāng)用途的植物樣品的直接PCR檢測，可以輕松完成長度達(dá)到5kb的DNA片段的擴(kuò)增。
本試劑盒提供了可專門用于植物樣品的2倍濃度的PCR預(yù)混液，并且PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳無需添加上樣緩沖液。本產(chǎn)品含有耐葉綠素的PlantTaq™ DNA聚合酶，這是一種經(jīng)過基因工程改造的非常高效的適用于植物樣品直接PCR檢測的耐熱DNA聚合酶。
對于植物葉片等柔嫩樣品可以直接PCR檢測，無須提取DNA。本產(chǎn)品對玉米、絲瓜、甜椒、豆角、黃豆、辣椒、黃瓜、茄子、番茄等植物樣品中的葉綠素、多糖、多酚等各種PCR抑制劑表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗性，對于新鮮采集的、4℃保存或低溫凍存的這些植物的葉片、嫩種子等，都無需進(jìn)行DNA提取純化，可以直接用于PCR擴(kuò)增目的DNA。
所需樣品少，耐受能力高。本產(chǎn)品用于20μl的PCR擴(kuò)增體系時，通常僅加入0.1-1mm直徑葉片即可順利完成PCR檢測。
本產(chǎn)品提供了一對陽性對照引物，便于確認(rèn)PCR檢測效果。該對引物是多種植物的通用引物，可以擴(kuò)增多數(shù)植物葉綠體中高度保守的IRB18基因的297bp DNA片段。
本產(chǎn)品用于植物葉片檢測的效果參考圖1。圖中可見，本產(chǎn)品對多種常見植物葉片都有很好的PCR擴(kuò)增效果。
圖1. 植物基因型快速鑒定試劑盒檢測圖中所示不同植物葉片中目的基因的實(shí)測效果圖。使用BeyoPlant™植物基因型快速鑒定試劑盒中提供的Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X)和Control primer mix，在PCR體系中直接加入不同植物葉片，用于擴(kuò)增IRB18基因的297bp DNA片段后的電泳效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))；1, 豆角(Cowpea)；2, 黃豆(Soybean)；3, 絲瓜(Sponge gourd)；4, 甜椒(Capsicum)；5, 玉米(Maize)；6, 黃瓜(Cucumber)；7, 辣椒(Pepper)；8, 茄子(Eggplant)；9, 番茄(Tomato)。
本產(chǎn)品擴(kuò)增不同長度目的基因的效果參考圖2。圖中可見，本產(chǎn)品以番茄葉為模板可直接PCR擴(kuò)增出長達(dá)5kb的DNA片段。
圖2. 植物基因型快速鑒定試劑盒直接以番茄葉片為模板擴(kuò)增不同長度的目的基因的效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands)); 1, IRB18(297bp)；2, actin(693bp)；3, rbcL(1201bp)；4, rpoC2(2069bp)；5, rpoC2(3079bp)；6, rpoC2(3942bp)；7, rpoC2(5000bp)。
本產(chǎn)品擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物帶有3'-dA overhangs的粘性末端，可直接用于和T載體連接進(jìn)行TA克隆。
用途：植物葉片等比較柔嫩的組織樣品基因組DNA中目的基因的直接擴(kuò)增、基因分型(如基因缺失等)，以及基因敲除或轉(zhuǎn)基因植物基因型分析。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X)中含有的PlantTaq™ DNA Polymerase失活。
本產(chǎn)品如果用于50微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于40個和200個反應(yīng)；如果用于20微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于100個和500個反應(yīng)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7292S-1 | Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X) | 1ml |
| D7292S-2 | Control primer mix (10μM each) | 25μl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7292M-1 | Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X) | 1ml×5 |
| D7292M-2 | Control primer mix (10μM each) | 125μl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。適當(dāng)避免反復(fù)凍融。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用本產(chǎn)品時請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
設(shè)置PCR反應(yīng)體系時，20μl和50μl PCR體系中植物樣品的推薦用量分別為0.1-1mm和0.3-3mm直徑葉片或類似大小其它比較柔嫩的植物組織，可以直接添加到PCR體系中，無需進(jìn)行任何額外處理。經(jīng)測試本產(chǎn)品適用于柔嫩新鮮種子的直接PCR，但不適用于干硬種子的直接PCR。
PCR反應(yīng)結(jié)束之后，酌情3000-5000g離心3-5min以沉淀植物組織碎片，便于吸取上清用于電泳分析等。
需自備Nuclease-Free Water。推薦選購ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.融解并混勻試劑盒中的Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X)和Control primer mix (10μM each)，置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：
| 試劑 | 20μl體系 | 50μl體系 | 終濃度 |
| Nuclease-Free Water | 9μl | 22.5μl | - |
| Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X) | 10μl | 25μl | 1X |
| 引物混合物(10μM each) | 1μl | 2.5μl | 0.5μM each |
| 植物樣品 | 0.1-1mm直徑 | 0.3-3mm直徑 | - |
| 總體積 | 20μl | 50μl | - |
注意：
(a)模板使用量：作為PCR模板的植物組織用量，對于20μl和50μl PCR反應(yīng)體系，植物樣品的推薦用量分別為0.1-1mm和0.3-3mm直徑葉片或類似大小其它比較柔嫩的植物組織。如果模板為植物種子，盡量使用鮮嫩的植物種子。用干凈的解剖刀去掉種子外殼，剪下直徑約0.5-2mm的組織直接放入PCR管內(nèi)；若種子太小，如番茄種子，可直接使用1-2粒完整的種子放入PCR管內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。50μl PCR體系，植物葉片或是種子直徑不宜超過3mm，太多模板易造成PCR抑制成分偏多，影響PCR效果。推薦取兩份植物組織樣品進(jìn)行平行的PCR實(shí)驗(yàn)，以降低取樣的不穩(wěn)定性。為確保取樣的均一性，建議使用專用的打孔器或解剖刀進(jìn)行取樣，并注意防止取樣過程中的交叉污染。每一次取樣，可以用2%的次氯酸鈉溶液清洗打孔器或解剖刀。對于高GC含量的PCR擴(kuò)增，可以嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。
(b)引物濃度：通常引物的終濃度為0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體和待檢測植物組織積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))。
e.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：
| 步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 說明 |
| 1 | - | 94℃ | 5min | 起始變性 |
| 2 | 30-40 | 94℃ | 30sec | 變性 |
| 55℃ | 30sec | 退火 | ||
| 68℃ | 2min/kb | 延伸 | ||
| 3 | - | 68℃ | 10min | 最終延伸 |
| 4 | - | 4℃ | 長時間保持 | 臨時存放 |
注意：
a.起始變性(94℃，5min)可以使植物組織樣品裂解，釋放出可用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA。
b.需根據(jù)每次反應(yīng)的模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等適當(dāng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
c.對于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確�？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。
常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。向PCR體系中嘗試加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的試劑。
c.目的片段過長。盡管PlantTaq™ DNA Polymerase可以擴(kuò)增最長達(dá)5kb的DNA片段，但大多數(shù)時候更適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段。對于過長的目的片段的擴(kuò)增，需要適當(dāng)優(yōu)化引物和PCR反應(yīng)參數(shù)。
d.引物的二級結(jié)構(gòu)、引物二聚體或引物偏短會導(dǎo)致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索最佳的退火溫度。
f.延伸時間不足�？砂凑彰�1kb片段延伸2分鐘進(jìn)行設(shè)置，對于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸3-4分鐘。
g.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
h.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為30-40。
i.模板用量偏少，可以在耐血體積范圍內(nèi)適當(dāng)加大樣品用量，或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對PCR引物，然后對第一次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時也可以從第一次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對第一次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
j.對PCR引物進(jìn)行脫鹽甚至PAGE膠或HPLC純化。
k.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當(dāng)提高退火溫度。
l.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ䦟τ趯?shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有很大幫助。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高 2-5℃。
b.減少植物組織樣品的用量。
c.在室溫配制PCR體系容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系。
d.如果模板的GC含量過高，需要考慮加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的試劑。
e.適當(dāng)縮短延伸時間。
