Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Calcein/PI Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit，或Calcein/PI Live/Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit)是一種非常便捷的基于Calcein-AM (鈣黃綠素)和PI (碘化丙啶)雙熒光染色法檢測動物細(xì)胞死活的試劑盒。

本試劑盒使用便捷，熒光染色和檢測僅需約30分鐘。本試劑盒染色30分鐘后，就可進(jìn)行后續(xù)的熒光顯微鏡拍照、流式分析或者熒光酶標(biāo)儀定量等熒光檢測和分析。

本試劑盒的原理是兩種探針可分別檢測細(xì)胞內(nèi)酯酶活性和細(xì)胞膜完整性，從而反映細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性。其中Calcein AM染色活細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色熒光；而碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色死細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。本試劑盒用于檢測動物細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性效果參考圖1。

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圖1. Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒用于L929細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測的效果圖。L929細(xì)胞(也稱L-929細(xì)胞)在明場視野下仔細(xì)觀察可以看到有明顯的壞死細(xì)胞(圖A)；綠色熒光標(biāo)記的即為Calcein染色的活細(xì)胞(圖B)，紅色熒光標(biāo)記的即為PI染色的死細(xì)胞(圖C)；Calcein和PI雙染疊加(merge)后可以非常清晰地觀察到活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光染色差別(圖D)。在本實(shí)驗(yàn)中，L929細(xì)胞經(jīng)TSZ處理3小時。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細(xì)胞程序性壞死誘導(dǎo)試劑(C1058)。實(shí)測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是一種可以對活細(xì)胞進(jìn)行熒光染色的細(xì)胞染色試劑，Calcein AM是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎(chǔ)上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團(tuán)，加強(qiáng)了疏水性，因此能夠很容易穿透細(xì)胞膜。Calcein AM本身并沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被活細(xì)胞中內(nèi)源性酯酶水解生成具有強(qiáng)負(fù)電荷的不能通透細(xì)胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，而Calcein可發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。由于死細(xì)胞缺乏酯酶或酯酶活性很低，Calcein AM進(jìn)入細(xì)胞后含有酯酶的活細(xì)胞可以產(chǎn)生Calcein，而死細(xì)胞不能或很少能產(chǎn)生Calcein，因此僅活細(xì)胞會被染色為強(qiáng)綠色熒光，死細(xì)胞不能被染色或者染色非常弱。核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，而只能染色細(xì)胞膜完整性被破壞的死細(xì)胞。因此，Calcein AM與碘化丙啶聯(lián)合使用，對活細(xì)胞和死細(xì)胞同時進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧�，就能用于�?xì)胞活性與細(xì)胞毒性的檢測。

Calcein AM水解產(chǎn)物Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射光波長為517nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光波長為617nm。Calcein和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖2。

圖2. Calcein和PI-DNA的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

本試劑盒可以用于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞的檢測。有報道稱Calcein AM也可以用于一些植物細(xì)胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細(xì)胞(root border-like cells)、一些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae和一些寄生蟲如Leishmania。由于一些寄生蟲細(xì)胞膜組分比較特殊的原因，Calcein AM不能進(jìn)入相應(yīng)的活細(xì)胞，但可以進(jìn)入凋亡早期的寄生蟲細(xì)胞，從而與PI聯(lián)用可以用于檢測凋亡早期的寄生蟲細(xì)胞。由于真菌和細(xì)菌有細(xì)胞壁，會阻礙Calcein進(jìn)入細(xì)胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細(xì)菌。本試劑盒與類似用途的臺盼藍(lán)染色液相比，更快捷且靈敏度更高。

本試劑盒提供的Calcein AM和PI為1000X溶液，使用非常便捷。并且這兩種溶液都經(jīng)過優(yōu)化，對大多數(shù)細(xì)胞都適用，但為得到比較理想的結(jié)果，也可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況對Calcein AM或PI在500-2000稀釋倍數(shù)之間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。同時，本試劑盒提供了檢測緩沖液，該緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果比PBS或HBSS更好。

對于96孔板，按推薦稀釋倍數(shù)配制相關(guān)檢測試劑，且每孔使用100μl，此時本試劑盒的小包裝、中包裝和大包裝分別可以檢測100次、500次和2500次。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。Calcein AM (1000X)和PI (1000X)需要避光保存。

注意事項：

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

Calcein AM (1000X)在潮濕環(huán)境中容易分解，首次使用時建議適當(dāng)分裝并-20℃密封保存。

由于Calcein AM在水溶液中不穩(wěn)定，Calcein AM檢測工作液須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能配制后凍存。

培養(yǎng)液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色可能有一定的影響，使熒光背景增強(qiáng)，建議在加入Calcein AM檢測工作液前適當(dāng)洗滌細(xì)胞。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Calcein AM/PI檢測工作液的配制:
按照96孔板每孔100μl Calcein AM/PI檢測工作液的體系，參考下表配制適量的Calcein AM/PI檢測工作液，并充分混勻。

注1：為得到比較理想的結(jié)果，可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)際染色效果對Calcein AM (1000X)和PI (1000X)在500-2000稀釋倍數(shù)之間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
注2：配制好的Calcein AM/PI檢測工作液必須一次使用完畢，不能凍存。
注3：也可以用其它合適的溶液，如無血清培養(yǎng)液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀釋Calcein AM (1000X)。本試劑盒配套提供的檢測緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。
2.熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板等多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿中或者細(xì)胞爬片上，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計對細(xì)胞進(jìn)行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1遍；對于懸浮細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的Calcein AM/PI檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實(shí)際染色效果對染色時間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。對于貼壁細(xì)胞L929，本產(chǎn)品的熒光染色效果參考圖1。如有需要，也可進(jìn)一步進(jìn)行其它熒光的復(fù)染，例如使用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。
3.流式細(xì)胞儀檢測：
a.細(xì)胞準(zhǔn)備。貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次；懸浮細(xì)胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個樣品推薦的細(xì)胞用量為106個細(xì)胞。
b.染色。對于上一步驟的106個細(xì)胞的沉淀，加入1ml Calcein AM/PI檢測工作液，重懸為單細(xì)胞懸液。37℃避光孵育30min。注：需要準(zhǔn)備好僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM/PI檢測工作液的緩沖液宜保持一致。同時準(zhǔn)備兩管額外的細(xì)胞樣品，每管只加入一種染料(Calcein AM或PI)，用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。
c.檢測。孵育完成后，可以直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細(xì)胞，吸凈液體后每個樣品加入0.5ml緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色，例如使用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。染色后，將樣品置于冰上，并盡量在1小時內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和分析。
注1：使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品用于流式細(xì)胞儀的陰性對照設(shè)置。
注2：細(xì)胞圈門(gate)時，注意不要圈入細(xì)胞碎片，并使用Calcein AM或PI單染的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)補(bǔ)償。雙染細(xì)胞流式檢測應(yīng)獲得兩個相對獨(dú)立的細(xì)胞群：綠色熒光的活細(xì)胞群和紅色熒光的死細(xì)胞群。
注3：由于流式檢測比較靈敏，使用的熒光探針濃度可能要比熒光顯微鏡檢測時要低，此時可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)際染色情況對Calcein AM或PI的稀釋倍數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
4.熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞死活的變化：
a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)，每孔的細(xì)胞數(shù)需要控制在100-10,000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計對細(xì)胞進(jìn)行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1遍；對于懸浮細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的Calcein AM/PI檢測工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37℃避光孵育30min。不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實(shí)際染色效果對染色時間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，用熒光酶標(biāo)儀檢測(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。通過對比對照組與處理組的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出死細(xì)胞與活細(xì)胞數(shù)量的變化。
5.熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞死活的比例：本方法通過設(shè)置對照，可計算出死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例。
a.細(xì)胞培養(yǎng)和處理同前。
b.除配制Calcein AM/PI檢測工作液外，還需要配制單獨(dú)的Calcein AM檢測工作液和PI檢測工作液用于對照的檢測。配制方法和稀釋倍數(shù)與Calcein AM/PI檢測工作液的配制一致。
c.檢測樣品組和對照組設(shè)置：
對于下面組別的細(xì)胞或無細(xì)胞組，需要保持細(xì)胞數(shù)量、檢測工作液濃度、孵育時間和孵育溫度的完全一致。

活細(xì)胞組為沒有加入藥物處理的細(xì)胞；死細(xì)胞組可用0.1-0.5%洋地黃皂苷(ST1272)或0.1%皂素處理細(xì)胞10分鐘，或70%乙醇孵育細(xì)胞30分鐘即可得到死細(xì)胞。
d.染色和檢測步驟同前。
e.根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計算死細(xì)胞與活細(xì)胞的比例：
% Live Cells =F(517)sam-F(517)min
F(517)max-F(517)min×100%
% Dead Cells =F(617)sam-F(617)min
F(617)max-F(617)min×100%
注1：其中所有的F(517)和F(617)都減去相應(yīng)的F(517)0和F(617)0。
注2：如果需要確定活細(xì)胞與死細(xì)胞的具體數(shù)量，可制作不同數(shù)量活細(xì)胞與死細(xì)胞在517nm和617nm處的熒光光譜標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性關(guān)系，因此通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中兩個染料的熒光強(qiáng)度可計算出活細(xì)胞與死細(xì)胞的數(shù)量。​