Calcein AM細(xì)胞活性檢測試劑盒(Calcein AM Cell Viability Assay Kit)是一種通過Calcein-AM熒光探針標(biāo)記活細(xì)胞從而簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確地用于細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖檢測的試劑盒。本試劑盒由于能用于活細(xì)胞的精確定量，也被稱為細(xì)胞熒光計數(shù)試劑盒(Cell Fluorescence Counting Kit)，簡稱Cell Fluorescence Counting Kit-F、CCK-F或CCKF。

本試劑盒檢測速度快，僅需約30分鐘即可完成細(xì)胞活性檢測。
本試劑盒檢測靈敏度高，線性范圍寬。本試劑盒可檢測低至50個活細(xì)胞，并且在50-50,000個細(xì)胞范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。對于不同的細(xì)胞線性范圍略有差別。
本試劑盒通常推薦使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行定量檢測，也可以使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測。如果有必要，也可以使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞的熒光檢測。
Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是一種可滲透進(jìn)入細(xì)胞、常用于測定真核細(xì)胞活力或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的綠色熒光探針，近年來也被廣泛用于細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖的檢測。
Calcein AM是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎(chǔ)上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團，加強了疏水性，因此能夠很容易穿透活細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而標(biāo)記細(xì)胞。Calcein AM本身并無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞中內(nèi)源性酯酶水解生成具有強負(fù)電荷的不能通透細(xì)胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，而Calcein可發(fā)出強綠色熒光。與其它同類探針相比，由于Calcein AM的細(xì)胞毒性非常低，幾乎不會影響細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖或淋巴細(xì)胞的趨化性等，而且對pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前活細(xì)胞熒光染色的最理想探針之一。
由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein AM進(jìn)入細(xì)胞后僅活細(xì)胞會被染色為綠色熒光，所以可對活細(xì)胞進(jìn)行定量熒光檢測。本檢測方法無需任何放射性同位素標(biāo)記(如[3H]-thymidine摻入法)或溶解步驟(如MTT檢測)，通常無須洗滌，即可獲得高度可重復(fù)性和精確性的細(xì)胞增殖檢測結(jié)果。本試劑盒用于活細(xì)胞數(shù)量熒光檢測的結(jié)果參考圖1。
圖1. Calcein AM細(xì)胞活性檢測試劑盒用于檢測MOLM13 (人急性髓原白血病細(xì)胞)活細(xì)胞數(shù)量的效果圖。MOLM13細(xì)胞經(jīng)計數(shù)后按3倍稀釋接種到BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)中，加入Calcein AM檢測工作液孵育30分鐘，隨后直接在熒光酶標(biāo)儀下檢測Ex/Em=494/517nm。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜而只能染色細(xì)胞膜完整性被破壞的死細(xì)胞，所以Calcein AM常常與碘化丙啶(ST511)聯(lián)合使用，對活細(xì)胞和死細(xì)胞同時進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧�。本試劑盒中的Calcein AM (1000X)與碘化丙啶(需另購，ST511/ST512/ST1569)用于活細(xì)胞和死細(xì)胞雙染的結(jié)果參考圖2。
圖2. Calcein AM細(xì)胞活性檢測試劑盒與碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)聯(lián)合使用檢測L-929活細(xì)胞與死細(xì)胞的效果圖。L-929細(xì)胞在明場視野下可見明顯的壞死細(xì)胞(圖A)；綠色熒光標(biāo)記的即為Calcein染色的活細(xì)胞(圖B)，紅色熒光標(biāo)記的即為PI染色的死細(xì)胞(圖C)；Calcein和PI雙染merge后更可以觀察到活細(xì)胞和死細(xì)胞的差別(圖D)。在本實驗中，L-929細(xì)胞經(jīng)TSZ處理3小時。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細(xì)胞程序性壞死誘導(dǎo)試劑盒(C1058)。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
本試劑盒可以應(yīng)用于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞。有報道稱Calcein AM也可以用于某些植物細(xì)胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細(xì)胞(root border-like cells)及某些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae。某些寄生蟲如Leishmania由于細(xì)胞膜組分的原因，Calcein AM不能進(jìn)入活細(xì)胞，但卻可以進(jìn)入凋亡早期的寄生蟲細(xì)胞，從而與PI聯(lián)用用于檢測凋亡早期的寄生蟲。由于真菌和細(xì)菌有細(xì)胞壁，會阻礙Calcein進(jìn)入細(xì)胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細(xì)菌。
Calcein本身是一種金屬絡(luò)合指示劑，在生理pH條件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金屬離子絡(luò)合時，熒光信號會發(fā)生淬滅。使用本試劑盒的時候需要避免在細(xì)胞培養(yǎng)液中額外添加這些影響Calcein熒光的物質(zhì)。Calcein AM及其水解產(chǎn)物Calcein的分子結(jié)構(gòu)式參考圖3。
圖3. Calcein AM及其水解產(chǎn)物Calcein的分子結(jié)構(gòu)式。
Calcein AM的水解產(chǎn)物Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射波長為517nm。Calcein的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖4。
圖4. Calcein的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。
本試劑盒提供的Calcein AM為1000X溶液。該1000X的Calcein AM溶液經(jīng)過優(yōu)化，對大多數(shù)細(xì)胞都適用，但為得到比較理想的結(jié)果，也可根據(jù)細(xì)胞類型和實驗實際情況對Calcein AM在500-2000稀釋倍數(shù)之間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。本試劑盒同時提供適合Calcein AM染色的檢測緩沖液，該染色液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果比PBS或HBSS更好。
各種細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇
對于96孔板，按1:1000配制Calcein AM檢測工作液，且每孔使用100μl Calcein AM檢測工作液，此時本試劑盒C2013S可進(jìn)行100次檢測，C2013M可進(jìn)行500次檢測，C2013L可進(jìn)行2500次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Calcein AM (1000X)需要避光保存。
注意事項：
如果后續(xù)使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光定量檢測，細(xì)胞須接種于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)中。
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
Calcein AM (1000X)在潮濕環(huán)境中容易分解，收到產(chǎn)品后建議適當(dāng)分裝并-20℃密封保存。
由于Calcein AM在水溶液中不穩(wěn)定，Calcein AM檢測工作液須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能配制后凍存。
培養(yǎng)液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色可能有一定的影響，使熒光背景增強，建議在加入Calcein AM檢測工作液前適當(dāng)洗滌細(xì)胞。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Calcein AM檢測工作液的配制：
按照96孔板每孔100μl Calcein AM檢測工作液的體系，參考下表配制適量的Calcein AM檢測工作液，需充分混勻。

注1：為得到比較理想的結(jié)果，可根據(jù)細(xì)胞類型和實際情況對Calcein AM (1000X)在500-2000稀釋倍數(shù)之間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
注2：配制好的Calcein AM檢測工作液必須一次使用完畢，不能凍存。
注3：也可以用其它合適的緩沖液，如無血清培養(yǎng)液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀釋Calcein AM (1000X)。本試劑盒配套提供的檢測緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。
2.貼壁細(xì)胞的熒光酶標(biāo)儀檢測或熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板等多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿中或者細(xì)胞爬片上，按實驗設(shè)計對細(xì)胞進(jìn)行一定處理。如果用于96孔熒光酶標(biāo)儀檢測，細(xì)胞須接種于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)中，每孔的細(xì)胞數(shù)需要控制在100-10000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。
b.洗滌(選做)。吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的Calcein AM檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，可以直接用熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長517nm，490nm和520nm也可以)檢測熒光并計算細(xì)胞活性，細(xì)胞活性和熒光強度成正比。根據(jù)具體的實驗?zāi)康�，也可以在熒光顯微鏡下觀察染色效果。對于貼壁細(xì)胞L-929，本產(chǎn)品與PI聯(lián)合使用的效果參考圖2。如有需要，也可進(jìn)一步進(jìn)行其它熒光的復(fù)染。例如使用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細(xì)胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需避光操作。
3.懸浮細(xì)胞的熒光酶標(biāo)儀檢測或熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板等多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按實驗設(shè)計對細(xì)胞進(jìn)行一定處理。如果用于96孔熒光酶標(biāo)儀檢測，細(xì)胞須接種于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)中，每孔的細(xì)胞數(shù)需要控制在100-10000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。
b.洗滌(選做)。250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1-2遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的Calcein AM檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，可以直接用熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長517nm，490nm和520nm也可以)檢測熒光并計算細(xì)胞活性，細(xì)胞活性和熒光強度成正比。根據(jù)具體的實驗?zāi)康�，也可以在熒光顯微鏡下觀察染色效果。對于懸浮細(xì)胞MOLM13，本產(chǎn)品未經(jīng)洗滌直接使用熒光酶標(biāo)儀檢測不同細(xì)胞數(shù)的效果參考圖1。
4.流式細(xì)胞儀檢測：
a.細(xì)胞準(zhǔn)備。貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次。懸浮細(xì)胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個樣品推薦的細(xì)胞用量為106。
b.染色。對于上一步驟的106個細(xì)胞的沉淀，加入1ml Calcein AM檢測工作液，重懸為單細(xì)胞懸液。37℃避光孵育30min。注：需要準(zhǔn)備好僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM檢測工作液的緩沖液宜保持一致。
c.檢測。孵育完成后，可以直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細(xì)胞，吸凈液體后每個樣品加入0.5ml緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測。如有需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色。例如使用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細(xì)胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需避光操作。染色后，將樣品置于冰上，盡量在1小時內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和分析。注意使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品用于流式細(xì)胞儀的陰性對照設(shè)置。

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