研發(fā)生產(chǎn)的小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(Small RNA 3′-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)，是一種提供了5’腺苷化和3’封閉的Universal miRNA Cloning Linker及相應(yīng)的連接酶和配套試劑，用于miRNA等3’端為羥基的小RNA和接頭連接的試劑盒。3’端連接了接頭的小RNA后續(xù)可以用于其克隆、高通量測(cè)序建庫(kù)或PCR檢測(cè)等。
本試劑盒也可以用于3’端為羥基的單鏈DNA和接頭的連接，因此也可以稱為單鏈DNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(ssDNA 3'-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)，或核酸3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(3’-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)。
本試劑盒提供的Universal miRNA Cloning Linker，其5´端腺苷�；�(也稱5'端預(yù)腺苷�；�5'端預(yù)腺苷化，5'pre-adenylated或5'pre-adenylation)，3'端氨基封閉，可以用于3’端為羥基的RNA的3’端接頭的添加。本試劑盒中提供的T4 RNA Ligase2, truncated可以識(shí)別“活化”的5´端腺苷酰化的Universal miRNA Cloning Linker，在無(wú)需ATP存在的條件下，可將Universal miRNA Cloning Linker的5´端與另外一條單鏈寡核苷酸的3´端羥基共價(jià)連接。
使用本試劑盒和miRNA連接時(shí)，可以有效避免miRNA的自連、不同miRNA之間的連接、Linker的環(huán)化或Linker分子之間的連接，而僅發(fā)生Linker 5'端和miRNA 3'羥基之間的特異性連接。
本試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效果請(qǐng)參見(jiàn)圖1。
圖1. 生產(chǎn)的小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)和ssRNA的效果圖。反應(yīng)體系為20μl，Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)的終濃度為1μM，單鏈RNA的終濃度為0.5μM，反應(yīng)條件為25℃孵育60min，反應(yīng)完畢后立即取樣在65℃孵育20min終止反應(yīng)，加入變性上樣緩沖液并在95℃孵育5min后放至冰浴中，隨后用15%尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，最終進(jìn)行核酸染色和熒光成像分析。如圖所示，本試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效率非常高。
本試劑盒提供的Universal miRNA Cloning Linker的序列是：5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´。該序列同NEB公司的S1315S Universal miRNA Cloning Linker。
本試劑盒如果用于20µl的反應(yīng)體系，并按照本試劑盒推薦的連接體系，可以用于20次的Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的連接反應(yīng)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0700S-1 | Universal miRNA Cloning Linker (6.9µM) | 29µl |
| R0700S-2 | DEPC-treated Water | 100µl |
| R0700S-3 | PEG8000 (50%, RNase Free) | 300µl |
| R0700S-4 | RNase Inhibitor (40U/μl) | 20µl |
| R0700S-5 | T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl) | 20µl |
| R0700S-6 | 10X T4Rnl2, truncated Buffer | 50µl |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
本試劑盒附帶提供的試劑均用DEPC水配制，可直接用于底物為單鏈RNA (3’端需為羥基)和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked) 的連接反應(yīng)。
使用本試劑盒連接ssRNA和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked)時(shí)，建議使用的PEG8000的濃度為10% -30%，適當(dāng)提高PEG8000的濃度，會(huì)顯著提高連接效率。
可根據(jù)具體應(yīng)用選擇合適的操作方法，可能需準(zhǔn)備額外的試劑，如RNase inhibitor、DEPC水等。
根據(jù)連接反應(yīng)的類型，推薦在反應(yīng)體系中加入適量的PEG8000。建議RNA環(huán)化反應(yīng)體系中PEG8000的終濃度為10%，連接單鏈RNA或DNA的分之間連接反應(yīng)體系中PEG8000的終濃度為15%-25%，這樣可以顯著提高酶活性，同時(shí)不影響反應(yīng)特性。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1.用于連接Universal miRNA Cloning Linker和單鏈RNA (ssRNA)的3’羥基末端時(shí)，參考下表在冰浴中配制如下反應(yīng)體系：
| Reagent | Volume | Final Concentration |
| ssRNA | xµl | 0.5µM |
| DEPC-treated Water | 2.55-xµl | - |
| Universal miRNA Cloning Linker (6.9µM) | 1.45µl | 0.5µM |
| PEG8000 (50%, RNase Free) | 12µl | 0.3 |
| 10X T4 Rnl2, truncated Buffer | 2µl | 1 X |
| RNase Inhibitor (40U/μl) | 1µl | 2U/μl |
| T4 RNA Ligase2, truncated | 1µl | - |
| Total Volume | 20µl | - |
注意：
a.由于涉及RNA操作，需要嚴(yán)格按照RNA操作的規(guī)范進(jìn)行，避免RNase污染，相關(guān)試劑和耗材需要經(jīng)過(guò)DEPC處理去除RNase或者確保是RNase free的。推薦在連接體系中添加RNase inhibitor，以避免ssRNA或其連接產(chǎn)物的降解，盡管經(jīng)測(cè)試我們發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格操作的情況下，不加RNase inhibitor也不會(huì)導(dǎo)致ssRNA或其連接產(chǎn)物發(fā)生明顯降解。
b.進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，通常推薦ssRNA和linker按照1:1進(jìn)行連接反應(yīng)，以適當(dāng)節(jié)約本試劑盒。如果樣品RNA比較珍貴，希望充分被連接，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比為2:1的比例進(jìn)行連接；如果樣品RNA比較充裕，同時(shí)感覺(jué)本試劑盒的成本偏高時(shí)，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比摩爾比1:1甚至1:2的比例進(jìn)行連接反應(yīng)，這樣可以很好地節(jié)省本試劑盒。
c.如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)連接反應(yīng)，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前預(yù)混合，然后再分裝到各反應(yīng)管內(nèi)。
2.連接反應(yīng)：25℃, 孵育60min。為了使連接反應(yīng)更加充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間。
3.終止反應(yīng)：65℃，孵育20min。
