Universal miRNA Cloning Linker (5´腺苷化3´封閉)，即通用miRNA克隆接頭(5´腺苷化3´封閉)或Universal miRNA Cloning Linker (5'adenylated, 3'blocked)，是一種常用于miRNA等3’端為羥基的RNA或3’端為羥基的單鏈DNA在克隆、高通量測序建庫或PCR檢測等時(shí)，在3’端添加的接頭。
本產(chǎn)品5´端腺苷�；�(也稱5´端預(yù)腺苷�；�5´端預(yù)腺苷化，5′ pre-adenylated或5′ pre-adenylation)，3´端氨基封閉，可以用于3’端為羥基的RNA的3’端接頭的添加。RNA連接酶可以識別“活化”的5´端腺苷�；谋井a(chǎn)品，在無需ATP存在的條件下，可將本產(chǎn)品的5´端與另外一條單鏈寡核苷酸的3´端羥基共價(jià)連接。利用5´端腺苷�；�，3´端封閉的本產(chǎn)品，加入RNA連接酶，在無需添加ATP的條件下，就能實(shí)現(xiàn)本產(chǎn)品5’端和目標(biāo)序列3’羥基的特異性共價(jià)連接。例如和miRNA連接時(shí)，可以有效避免miRNA的自連、不同miRNA之間的連接、本產(chǎn)品的自連或本產(chǎn)品不同鏈之間的連接，而僅發(fā)生本產(chǎn)品5’端和miRNA 3’羥基之間的特異性連接。
本產(chǎn)品的電泳圖和連接效果圖請參考圖1。圖中可見，本產(chǎn)品條帶清晰，純度高，與5’端為磷酸化的序列相比有顯著的電泳遷移率差異(圖1A)；并且本產(chǎn)品使用T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl2), truncated與ssRNA連接時(shí)，連接效率非常高(圖1B)。
圖1. Universal miRNA Cloning Linker Linker (5´腺苷化3´封閉)及其連接效果圖圖。圖A. 本產(chǎn)品5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´ (AppDNA)與5´-pCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´ (pDNA)的電泳對比圖。圖B. 本產(chǎn)品(AppDNA)與ssRNA使用T4 RNA ligase 2 (T4 Rnl2), truncated的連接效果圖。圖中可見本產(chǎn)品與ssRNA有非常高的連接效率。
本產(chǎn)品的寡核苷酸序列是：5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´。本產(chǎn)品的序列同NEB公司的S1315S Universal miRNA Cloning Linker。
本產(chǎn)品以水溶液的形式存在，濃度為40ng/µl，即6.9µM。
用途：本產(chǎn)品可以應(yīng)用于小RNA克隆、miRNA文庫構(gòu)建。
本產(chǎn)品的1µg小包裝約通�？梢赃M(jìn)行8-17次連接反應(yīng)，5µg中包裝約通�？梢赃M(jìn)行40-85次連接反應(yīng)。具體的連接反應(yīng)次數(shù)和反應(yīng)體系的體積和本產(chǎn)品的用量有關(guān)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0702S | Universal miRNA Cloning Linker (40ng/µl) | 1µg |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0702M | Universal miRNA Cloning Linker (40ng/µl) | 5µg |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。-80℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.使用本產(chǎn)品與ssRNA的3’羥基末端連接推薦使用T4 TNA Ligase 2, truncated。也可以使用T4 TNA Ligase 2, truncated,K227Q，或T4 TNA Ligase 2, truncated,T4 TNA Ligase 2, truncatedKQ (R55K, K227Q)。
2.參考下表在冰浴中配制如下反應(yīng)體系：
| Reagent | Volume | Final Concentration |
| ssRNA | xµl | 0.5µM |
| DEPC-treated Water | (1.1 or 2.55)-xµl | - |
| Universal miRNA Cloning Linker (6.9pmol/µl) | 2.9 or 1.45µl | 1 or 0.5µM |
| PEG8000 (50%, RNase Free) | 12µl | 0.3 |
| 10X Reaction Buffer | 2µl | 1 X |
| RNase Inhibitor (40U/μl) | 1µl | 2U/μl |
| T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl) | 1µl | 10U/µl - |
| Total Volume | 20µl | - |
注意：
a.由于涉及RNA操作，需要嚴(yán)格按照RNA操作的規(guī)范進(jìn)行，避免RNase污染，相關(guān)試劑和耗材需要經(jīng)過DECP處理去除RNase或者確保是RNase free的。推薦在連接體系中添加RNase Inhibitor，以避免ssRNA或其連接產(chǎn)物的降解，盡管經(jīng)測試我們發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格操作的情況下，不加RNase Inhibitor也不會(huì)導(dǎo)致ssRNA或其連接產(chǎn)物發(fā)生明顯降解。
b.進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，如果樣品RNA比較珍貴，希望充分被連接，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比為2:1的比例進(jìn)行連接；如果樣品RNA比較充裕，同時(shí)感覺本產(chǎn)品的成本偏高時(shí)，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比摩爾比1:1甚至1:2的比例進(jìn)行連接反應(yīng)，這樣可以很好地節(jié)省本產(chǎn)品。
c.如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)連接反應(yīng)，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前預(yù)混合，然后再分裝到各反應(yīng)管內(nèi)。
3.連接反應(yīng)：25℃, 孵育60min。為了使連接反應(yīng)更加充分，可以適當(dāng)延長連接反應(yīng)時(shí)間。
4.終止反應(yīng)：65℃，孵育15min。
