EdU-647細(xì)胞增殖檢測試劑盒( EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 647)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點擊反應(yīng)(Clickreaction)使EdU被Alexa Fluor 647所標(biāo)記，從而實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地檢測細(xì)胞增殖的試劑盒。

本試劑盒可以檢測到細(xì)胞或組織樣品中單個的增殖細(xì)胞，同時也可以對細(xì)胞或組織樣品總體的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行定量檢測。本試劑盒可以檢測培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品，也可以檢測組織切片。
經(jīng)本試劑盒處理后，增殖的細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)較強的遠(yuǎn)紅外熒光。通常該熒光探針被激發(fā)后，肉眼不能觀察到激發(fā)出來的長波長熒光，但可以被很多成像系統(tǒng)例如激光共聚焦顯微鏡等或有相應(yīng)激發(fā)和發(fā)射檢測模塊的流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀所檢測到，也可以用于高內(nèi)涵篩選(High-Content Screening, HCS)。流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測僅適用于細(xì)胞樣品，不適用于組織切片。
細(xì)胞增殖能力的檢測是評估細(xì)胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認(rèn)的最精確的檢測細(xì)胞增殖的方法是直接檢測細(xì)胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細(xì)胞增殖的方法是放射性標(biāo)記核苷摻入法，如氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實現(xiàn)單細(xì)胞檢測而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時會和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點擊反應(yīng)，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高，是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級換代的新方法，將會逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細(xì)胞活性的細(xì)胞增殖檢測方法，能檢測到細(xì)胞的總體增殖效果，但無法檢測到單個的增殖細(xì)胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的，但被廣泛用于替代[3H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細(xì)胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細(xì)胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細(xì)胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細(xì)胞儀檢測。在進(jìn)行科學(xué)研究時，上述這些基于細(xì)胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。(C0051、C1031)基于細(xì)胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細(xì)胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細(xì)胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細(xì)胞儀檢測。在進(jìn)行科學(xué)研究時，上述這些基于細(xì)胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通過一價銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)(Click reaction)，其反應(yīng)原理參見圖1。通過點擊反應(yīng)，新合成的DNA會被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記，從而可以使用適當(dāng)?shù)臒晒鈾z測設(shè)備檢測到增殖的細(xì)胞。

圖1. EdU檢測法中的點擊反應(yīng)(Click reaction)原理圖。熒光探針等標(biāo)記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細(xì)胞DNA中的EdU，在銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，最終使細(xì)胞DNA標(biāo)記上熒光探針或其它探針。

本試劑盒反應(yīng)簡單、檢測靈敏度高。本試劑盒基于簡單高效的點擊反應(yīng)，無需DNA變性，只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標(biāo)記出摻入的EdU，并且可以檢測到單個細(xì)胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使疊氮化物探針有效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)生點擊反應(yīng)，不會影響細(xì)胞形態(tài)，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細(xì)胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測細(xì)胞核)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進(jìn)入細(xì)胞并與DNA上的BrdU結(jié)合，需要對雙鏈DNA進(jìn)行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會影響細(xì)胞形態(tài)，影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等。BrdU法和 EdU法檢測原理的比較參見圖2。

圖2. BrdU法和 EdU法檢測原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體，由于空間位阻，雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結(jié)合。B. EdU法使用小分子標(biāo)記的疊氮化物(Azide)，無需DNA變性，操作更便捷，兼容性好，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

本試劑盒檢測快速。相對于至少需要4小時的BrdU法，本試劑盒采用的 EdU法檢測新合成的DNA只需1.5-2小時， 時間上大大縮短。本試劑盒同時提供了染色細(xì)胞核的Hoechst 33342，以方便染色觀察所有的細(xì)胞核�？梢允褂脽晒怙@微鏡或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行定性和定量檢測。Jurkat細(xì)胞用本試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖的效果參見圖3。

圖3. Jurkat細(xì)胞用本試劑盒標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖的效果圖。Jurkat細(xì)胞只用EdU標(biāo)記(左圖)，或在標(biāo)記的同時用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)處理(右圖)，2小時后用本試劑盒進(jìn)行點擊反應(yīng)，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。從圖中可以看出，僅EdU標(biāo)記的細(xì)胞有較高比例的遠(yuǎn)紅外熒光(647 fluorescence)陽性細(xì)胞，呈現(xiàn)遠(yuǎn)紅外熒光陰性(弱染色)和陽性(強染色)的兩個峰(左圖)，分別對應(yīng)于未增殖細(xì)胞和增殖細(xì)胞。經(jīng)過羥基脲處理的細(xì)胞，遠(yuǎn)紅外熒光陽性的細(xì)胞幾乎完全消失(右圖)，僅剩下一個遠(yuǎn)紅外熒光陰性的峰(右圖)。該檢測結(jié)果說明DNA合成被抑制后，EdU的摻入也被抑制。實測數(shù)據(jù)可能會因細(xì)胞類型、細(xì)胞增殖情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

各種細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇，請參考 http://www.beyotime.com/cell-proliferation.htm。
本試劑盒小包裝C0081S如果用于培養(yǎng)的細(xì)胞(6孔板)的檢測，可以檢測50個樣品，每個樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液；如果用于96孔板檢測，可以檢測500個樣品，每個樣品的檢測體系為50μl的Click反應(yīng)液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測，分別可以檢測125、250、350和1250個樣品，每個樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可以檢測50個樣品，每個細(xì)胞樣品的細(xì)胞數(shù)量宜為10-100萬，每個樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測，可以檢測125-250個樣品， 每個樣品的反應(yīng)體系為100-200μl的Click反應(yīng)液。大包裝C0081L可檢測樣品的數(shù)量為小包裝C0081S的4倍。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Azide 647和Hoechst 33342須避光保存。
注意事項：
Click Additive配制成溶液后請注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請棄用。

2.檢測體系的準(zhǔn)備
a.如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b.如果檢測的是懸浮細(xì)胞，請按常規(guī)的懸浮細(xì)胞的操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細(xì)胞相比，相關(guān)步驟需要增加離心步驟等，如1000×g室溫離心5min。
3.培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a.在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細(xì)胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d.繼續(xù)孵育細(xì)胞2小時。該孵育時間的長短取決于細(xì)胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等，細(xì)胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e.EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。注：對于流式細(xì)胞儀檢測，貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。
f.去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次3-5分鐘。
g.去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h.去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞1-2次，每次3-5分鐘。
i.轉(zhuǎn)步驟5。
4.動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進(jìn)食等適當(dāng)方式進(jìn)行動物的體內(nèi)標(biāo)記。如下以小鼠為例，其它動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請參考相關(guān)文獻(xiàn)。
a.對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨購買ST067。
b.4小時后或根據(jù)特定實驗確定的適當(dāng)時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。
c.對于冰凍切片：
(a)加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
(b)去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c)去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d)去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e)抗原修復(fù)(選做)：如果同時需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液，例如P0090冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X)，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
(f)轉(zhuǎn)步驟5。
d.對于石蠟切片：
(a)脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗原修復(fù)(選做)：如果同時需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液，例如P0081檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0083改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0085 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、P0086檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、P0088通用型強力抗原修復(fù)液(10X)、P0092漂片抗原修復(fù)液(10X)，或者自行配制適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。
(c)轉(zhuǎn)步驟5。
5.EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負(fù)面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細(xì)胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可，其余方法相同。
a.配制Click Additive Solution：對于C0078S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于C0078L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝，并-20℃保存。
b.參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點擊反應(yīng)可能無法有效進(jìn)行；同時，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。

c.去除上一步驟中的洗滌液。
d.每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.室溫避光孵育30分鐘。
f.吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
g.如果需要對細(xì)胞核進(jìn)行染色，可以參照步驟6進(jìn)行。如無其它的特殊需要，即可在可以檢測遠(yuǎn)紅外熒光的熒光顯微鏡下觀察，或者使用相應(yīng)的流式細(xì)胞儀、多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測，或者用高內(nèi)涵篩選儀器(一般高內(nèi)涵篩選需要使用染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色)進(jìn)行檢測。Azide 647的最大激發(fā)波長是650nm，最大發(fā)射波長是670nm。
6.細(xì)胞核染色
為了檢測細(xì)胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色。一般高內(nèi)涵篩選儀器也需要對細(xì)胞核進(jìn)行染色。
a.1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接上述步驟5g，吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘。
c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
d.用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
e.隨后即可進(jìn)行熒光檢測。Hoechst 33342為藍(lán)色熒光，最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm。
7.流式細(xì)胞儀檢測
對于經(jīng)步驟5或6獲得的細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行流式檢測。如果使用傳統(tǒng)的流體動力學(xué)聚焦的流式細(xì)胞儀來測量總DNA含量，請在檢測過程中使用低流速，實驗中的每個樣品應(yīng)使用相同的收集速率和細(xì)胞濃度。EdU標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號一般使用對數(shù)刻度的橫坐標(biāo)(如圖3中的橫坐標(biāo))。Azide 647的最大激發(fā)波長是650nm，最大發(fā)射波長是670nm。
注1：建議使用未經(jīng)EdU標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓。
注2：由于流式細(xì)胞儀檢測比較靈敏，可根據(jù)細(xì)胞類型和實際染色情況對Azide 647的使用量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。​