EdU細胞增殖檢測試劑盒(TMB法)( EdU Cell Proliferation Kit with TMB)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點擊反應(yīng)(Click reaction)使EdU被生物素(Biotin)所標(biāo)記，然后加入的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)與生物素結(jié)合，最后通過TMB顯色，從而實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地在96孔板等多孔板中定量檢測細胞增殖的試劑盒。

本試劑盒適合定量檢測培養(yǎng)的細胞或組織樣品的增殖水平。通常不推薦使用本試劑盒檢測組織切片樣品，盡管在提前進行EdU摻入的情況下，也是可以在多孔板中對于相同厚度和相同面積的組織切片樣品進行定量檢測的。
細胞增殖能力的檢測是評估細胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認(rèn)的最精確的檢測細胞增殖的方法是直接檢測細胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細胞增殖的方法是放射性標(biāo)記核苷摻入法，如氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實現(xiàn)單細胞檢測而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時會和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點擊反應(yīng)，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高，是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級換代的新方法，將會逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細胞活性的細胞增殖檢測方法，能檢測到細胞的總體增殖效果，但無法檢測到單個的增殖細胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的，但被廣泛用于替代[3H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細胞儀檢測。在進行科學(xué)研究時，上述這些基于細胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與生物素標(biāo)記的疊氮化物(Biotin labeled azide)通過一價銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)(Click reaction)，其反應(yīng)原理參見圖1。通過點擊反應(yīng)，新合成的DNA會被相應(yīng)的生物素探針?biāo)鶚?biāo)記，從而可以使用適當(dāng)?shù)臋z測設(shè)備檢測到增殖的細胞。

圖1.  EdU檢測法中的點擊反應(yīng)(Click reaction)原理圖。生物素或熒光探針等標(biāo)記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細胞DNA中的EdU，在銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，最終使細胞DNA標(biāo)記上生物素等探針。

本試劑盒反應(yīng)簡單、檢測靈敏度高。本試劑盒基于簡單高效的點擊反應(yīng)，無需DNA變性，只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標(biāo)記出摻入的EdU，并且可以檢測到單個細胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使疊氮化物探針有效進入細
胞并發(fā)生點擊反應(yīng)，不會影響細胞形態(tài)，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測細胞核)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進入細胞并與DNA上的BrdU結(jié)合，需要對雙鏈DNA進行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會影響細胞形態(tài)，影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等。BrdU法和 EdU法檢測原理的比較參見圖2。

圖2. BrdU法和 EdU法檢測原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體，由于空間位阻，雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結(jié)合。B. EdU法使用小分子標(biāo)記的疊氮化物(Azide)，無需DNA變性，操作更便捷，兼容性好，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

本試劑盒檢測快速。相對于BrdU法，本試劑盒采用EdU法檢測新合成的DNA，所需時間顯著縮短。
使用本試劑盒最終TMB顯色時，增殖的細胞會產(chǎn)生可溶性藍色產(chǎn)物，該藍色產(chǎn)物通�？梢栽�370nm或620-650nm測定吸光度；也可以加入2M H2SO4終止上述反應(yīng)，同時使溶液呈黃色，此時可以在450nm測定吸光度。使用本試劑盒的檢測效果的示例請參考圖3。

圖3. HeLa細胞使用本試劑盒檢測細胞增殖的效果圖。無EdU組(陰性對照組)呈現(xiàn)較低的吸光度；EdU (10μM)組(陽性組)吸光度較高；而用DNA合成抑制劑Hydroxyurea (10mM)提前預(yù)處理0.5小時(抑制劑組)后，吸光值顯著降低，幾乎和陰性對照組一致，說明DNA合成被抑制后，EdU的摻入被顯著抑制。

各種細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇，請參考 http://www.beyotime.com/cell-proliferation.htm。
本試劑盒小包裝C0088S如果用于96孔板檢測，可以檢測500個樣品，每個樣品的檢測體系為50μl的Click反應(yīng)液；如果用于384孔板樣品的檢測，可以檢測1250個樣品，每個樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為20μl。其它多孔板可以檢測的樣品數(shù)和每個樣品所需的反應(yīng)液用量以此類推。大包裝C0088L可檢測樣品的數(shù)量為小包裝C0088S的4倍。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Biotin Azide、TMB顯色液須避光保存。
注意事項：
Click Additive配制成溶液后請注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請棄用。
TMB對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
如果需要使用羥基脲(Hydroxyurea)作為對照，
如果用于動物實驗需要更多EdU，也可以從
由于本產(chǎn)品需要銅離子催化進行點擊反應(yīng)，請注意如下的兼容性問題及解決方案。本產(chǎn)品完全兼容有機類染料如Alexa Fluor®系列普通染料及fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料；對于Qdot®納米晶體探針、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor® 680-R-PE等，需要在點擊反應(yīng)完成后進行反應(yīng)和檢測；本產(chǎn)品會影響GFP、RFP、mCherry等熒光蛋白的熒光，對于熒光類蛋白如Green Fluorescent Protein (GFP)、TC-FlAsH™和TC-ReAsH™類試劑，需要在點擊反應(yīng)前進行反應(yīng)和檢測。由于Phalloidin (鬼筆環(huán)肽)不兼容點擊反應(yīng)，推薦使用
Tubulin-Tracker Red (C1050)進行細胞微管的檢測。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 需要用戶自己準(zhǔn)備的耗材和試劑
g. 根據(jù)實驗要求：696孔板或其它多孔板。
2. 檢測體系的準(zhǔn)備
a. 如下以96孔板檢測體系為例，如果使用384孔板等孔板，檢測體系可以相應(yīng)按比例調(diào)整。
b. 如果檢測的是懸浮細胞，請按常規(guī)的懸浮細胞的操作方式進行。例如和貼壁細胞相比，相關(guān)步驟需要增加離心步驟等。
3. 培養(yǎng)細胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a. 在96孔板中培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細胞。細胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b. 配制2X的EdU工作液：推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c. 將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，與培養(yǎng)液等體積加入96孔板中，使96孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計終濃度為10μM，原先96孔板中的培養(yǎng)基為0.1ml，則將0.1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如0.2ml培養(yǎng)液中加入22微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d. 繼續(xù)孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e. EdU標(biāo)記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入0.1-0.2ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
f. 去除固定液，每孔用0.1-0.2ml洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。
g. 去除洗滌液，每孔用0.1-0.2ml通透液(可以使用免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h. 去除通透液，每孔用0.1-0.2ml洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。
i. 再用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
j. 轉(zhuǎn)步驟4。
4. EdU檢測
注意：本步驟96孔板中每孔的反應(yīng)體系為50μl的反應(yīng)混合物。對于384孔板，每孔的反應(yīng)的體系為20μl的反應(yīng)混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加，可以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負(fù)面影響。
a. 配制Click Additive Solution：對于C0088S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于C0088L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝，并-20℃保存。
b. 參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點擊反應(yīng)可能無法有效進行；同時，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。

c. 去除上一步驟中的洗滌液。
d. 每孔加入50μl Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e. 室溫避光孵育30分鐘。孵育時需注意在多孔板的空隙中加水，以盡量減少反應(yīng)液的蒸發(fā)。
f. 吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
5. Streptavidin-HRP工作液的配制：
a. Streptavidin-HRP工作液的配制：
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，須充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。

6. 樣品的顯色：
a. 在樣品上加20μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30分鐘。
注：Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆蓋樣品為準(zhǔn)。孵育時需注意在多孔板的空隙中加水來保持濕潤，以盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發(fā)。
b. 用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
c. 加入0.1mlTMB顯色液，室溫孵育5-30分鐘或根據(jù)顯色情況孵育適當(dāng)時間。
注：如果顯色很強可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當(dāng)延長顯色時間，甚至顯色過夜。
d. 直接在370nm或620-650nm測定吸光度�；蚣尤�25微升2M H2SO4終止反應(yīng)，隨后在450nm測定吸光度。​